甜菜碱基低共熔溶剂提取葡萄藤枝条酚类化合物：体系筛选、工艺优化及细胞毒性评价

《Foods》：Betaine-Based Deep Eutectic Solvents for Phenolic Compounds Extraction from Vine Shoots: Screening, Optimisation, and Cytotoxicity Assessment

　　

为了开发具有生物活性化合物的可持续提取方法，本研究评估了基于甜菜碱的低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）的潜力。研究人员将甜菜碱作为天然、安全的氢键受体（hydrogen-bond acceptor，HBA），在十四种DES中采用多元醇/糖/酸作为氢键供体（hydrogen-bond donor，HBD），用于提取葡萄藤枝条（vine shoots，VS）中的酚类化合物。以常规溶剂59%（v/v）乙醇/水作为对照。在测试的DES中，以甜菜碱:乙二醇:水（1:3:5）和甜菜碱:山梨糖醇:水（3:1:10）制备的提取物表现出较高的提取能力。其中甜菜碱:乙二醇:水（1:3:5）DES所得提取物具有最优的生物相容性特征，并在室温下具有足够的稳定性。采用响应面法（response surface methodology，RSM）对该DES提取VS的过程进行优化，考察了温度、时间和固液比的影响。在80 °C、127 min、液固比（liquid-to-solid ratio，L/S）10:1的条件下，总酚含量（total phenolic content，TPC）和抗氧化活性（EC₅₀为162.5 mg extract/mL）均得到提升。此外，通过高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC-QTOF-MS）对DES提取物进一步分析，突出了高需求抗氧化剂反式白藜芦醇（16 μg/mL）及其二聚体反式-ε-葡萄素（31 μg/mL）的存在。据研究人员所知，这是首次评估基于甜菜碱的DES用于VS提取，并同时进行表征和细胞毒性评估，同时讨论其局限性的研究。

葡萄藤枝条（vine shoots，VS）是葡萄栽培中每年修剪产生的主要农业废弃物，每公顷产量约2–4吨，其木质纤维素基质中富含酚类化合物，尤其是二苯乙烯类（stilbenes）如反式白藜芦醇和反式-ε-葡萄素，这些物质具有高抗氧化活性，可作为功能成分。传统有机溶剂或水醇混合物提取虽有效，但存在安全、环境和溶剂回收问题。低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）因可调性和绿色属性成为替代选择，但多数研究只重视提取率，忽略存储稳定性和生物相容性等工业关键标准。甜菜碱作为天然安全的氢键受体（hydrogen-bond acceptor，HBA），与多元醇/糖/酸等氢键供体（hydrogen-bond donor，HBD）组成的DES在“即用型”提取物方面具有前景，但需要系统评估。

本研究旨在评估14种甜菜碱基DES从VS中回收抗氧化酚类化合物的潜力，以59%乙醇/水为对照，整合了溶剂筛选、生物相容性、稳定性、优化和表征。结果显示，甜菜碱:乙二醇:水（1:3:5）和甜菜碱:山梨糖醇:水（3:1:10）提取效率高；前者生物相容性最好且室温稳定。响应面法优化得80 °C、127 min、液固比10:1，TPC达2.35 mg GAE/mL，EC₅₀为162.5 mg extract/mL，并含有反式白藜芦醇16 μg/mL和反式-ε-葡萄素31 μg/mL。该研究首次对甜菜碱基DES提取VS进行表征和细胞毒性评估，并讨论了局限，为绿色化学和循环生物经济提供了新论据。

关键技术方法：样本为品种‘Charelo’的VS，室温干燥后粉碎至约1 mm。研究人员制备14种DES（HBA为甜菜碱，HBD包括乙二醇、丙二醇、甘油、山梨糖醇、乳酸和葡萄糖），并与59%乙醇/水对照提取。初步提取后通过Folin–Ciocalteu法测TPC，通过DPPH、FRAP、ABTS法测抗氧化活性，筛选出DES 3和DES 9进行60天稳定性试验及HaCaT、L929、Caco-2细胞系MTS法细胞毒性试验。随后选择DES 3，用Box–Behnken设计结合响应面模型优化温度（40–80 °C）、时间（60–180 min）和L/S比（10:1–30:1）。最优提取物用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）定量二苯乙烯类，用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱/质谱（HPLC-QTOF-MS/MS）鉴定酚类组成。

研究结果：

3.1 DES体系筛选
14种DES提取表明，TPC为0.41–0.82 mg GAE/mL（9.4–18.9 mg GAE/g干VS），EC₅₀为611.2–1522.1 mg extract/mL。甜菜碱:乙二醇:水（1:3:5和1:3:10）提取物TPC约0.8 mg GAE/mL，与乙醇对照相当；增加水含量可提高提取率约31%，但并非所有体系都如此。因此选择DES 3和DES 9进行后续研究。

3.2 所选提取物的细胞毒性
在HaCaT、L929和Caco-2细胞中，乙醇对照在高浓度时细胞毒性最明显（如HaCaT在200 μL/mL时活力37.3%），DES 3在所有浓度下保持高活力（HaCaT中200 mg extract/mL时99.9%），DES 9在高浓度下活力降至60%以下。表明HBD类型显著影响生物相容性。

3.3 稳定性研究
60天存储后，室温光照下DES 3的TPC下降4.6%（无显著差异），乙醇对照下降10.1%，DES 9下降5.2%；EC₅₀小幅上升。40 °C暗处下，三种提取物TPC下降约9%–10%，但DES 3和DES 9的EC₅₀上升约34%，大于乙醇对照（3.9%）。因此室温下DES 3最稳定，40 °C下乙醇对照更稳定。

3.4 因素对DES提取的影响
Box–Behnken实验显示，温度和L/S比是最重要因素。低L/S比（10:1）时提取液浓度和活性最高（run 5：TPC 2.25 mg GAE/mL，EC₅₀ 158.1 mg extract/mL）；高L/S比（30:1）时单位生物量产率最高（36.0 mg GAE/g），但浓度被稀释。低温下延长提取时间有利，高温下时间影响不显著。

3.5 优化与表征
多响应优化预测最佳条件为80 °C、127 min、L/S 10:1。实验验证TPC为2.35±0.05 mg GAE/mL（30.3±0.6 mg GAE/g干VS），EC₅₀为162±6 mg extract/mL，与预测误差小于6%。FRAP和ABTS值高于乙醇对照。HPLC-UV定量反式白藜芦醇16±2 μg/mL，反式-ε-葡萄素31±3 μg/mL；HPLC-QTOF-MS/MS鉴定出共23种酚类化合物（10种二苯乙烯、7种酚酸及其衍生物、2种酚醛、4种黄烷-3-醇）。

3.6 最佳提取物的细胞毒性
优化后提取物在HaCaT细胞中仅在200 mg extract/mL时活力降至65.0%；L929最敏感，50 mg extract/mL时已低于70%；Caco-2最耐受，200 mg extract/mL时仍有70.3%。表明优化条件提高了提取物活性负荷，可能增强细胞毒性，需重新评估。

3.7 研究局限性
虽然DES被视为绿色溶剂，但乙二醇作为HBD存在潜在毒理学问题（体内代谢生成乙醇酸和草酸盐）。现有细胞实验仅是初步安全性证据，尚需体内、代谢组学及药物代谢研究。此外，需发展超声、微波等绿色强化技术以降低能耗。

讨论部分总结：研究人员将结果与文献对比，指出DES提取能力与酚类谱而非仅TPC相关；DES细胞毒性不能由组分简单加和预测，乙二醇在某些体系中可能降低毒性。溶剂选择应同时考虑提取率、稳定性、安全性和最终应用场景。

研究结论翻译：基于甜菜碱的DES被证明是从VS中回收具有抗氧化活性（通过DPPH法测定）的酚类化合物的有效溶剂。对14种配方的筛选表明，HBD和水含量对提取率有重要影响。筛选确定了甜菜碱-乙二醇-水（1:3:5）体系，因为它具有与对照乙醇提取物相当的产率、良好的稳定性和改善的生物相容性。利用RSM确定了最佳条件：80 °C、127 min、L/S 10:1，所得提取物酚含量为2.35 mg GAE/mL（30.3 mg GAE/g干VS），EC₅₀为162 mg/mL，并含有反式白藜芦醇和反式-ε-葡萄素。然而，优化后酚类化合物浓度增加虽不大，但按细胞系和剂量增强了细胞毒性反应。总体而言，这些结果初步支持使用甜菜碱基DES从VS中提取包括反式白藜芦醇及其二聚体在内的酚类化合物并获得具有抗氧化活性的提取物。但所研究的提取物仍需未来代谢组学和体内研究，以深入理解其抗氧化活性、全身效应及代谢产物；其毒理学特性也需要通过体内研究加以确认。未来还应应用超声或微波等绿色强化技术，以实现更节能的提取。