《Foods》：Indigenous Yeasts from a Maceratino Vineyard: Sequential Fermentation as a Strategy to Enhance Wine Complexity
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本研究调查了与意大利中部本土马塞拉蒂诺（Maceratino）葡萄品种相关的本土酵母，评估了所选分离株的酿酒潜力，并进行了后续的顺序发酵试验。通过直接分离和自动富集方法共收集了163株酵母分离株，其中35株通过分子方法鉴定，16株代表性菌株被表征其酿酒特性。本
本研究调查了与意大利中部本土马塞拉蒂诺（Maceratino）葡萄品种相关的本土酵母，评估了所选分离株的酿酒潜力，并进行了后续的顺序发酵试验。通过直接分离和自动富集方法共收集了163株酵母分离株，其中35株通过分子方法鉴定，16株代表性菌株被表征其酿酒特性。本土酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株表现出与商业发酵剂相当的发酵性能，而非酿酒酵母（non-Saccharomyces）菌种尽管发酵能力有限，却展现出互补的技术特性。基于整体筛选，选择了4株本土菌株进行纯发酵和顺序发酵试验：酿酒酵母DiSVA 898分别与美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）DiSVA 875、仙人掌汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae）DiSVA 883和耐热拉钱斯酵母（Lachancea thermotolerans）DiSVA 890进行纯发酵和顺序发酵。顺序接种产生了具有独特挥发性和感官特征的葡萄酒，每种酒均展现出独特的香气特征。值得注意的是，涉及耐热拉钱斯酵母DiSVA 890的顺序发酵策略提供了显著的生物酸化作用，产生了2.16 g/L的乳酸，并增强了乙酸异戊酯和β-苯乙醇的含量，而使用美极梅奇酵母DiSVA 875的顺序接种流程则提高了高级醇和酯类浓度。总体而言，研究结果表明，酿酒酵母和非酿酒酵母本土酵母是开发混合发酵剂的重要来源，为本地分离株调节马塞拉蒂诺葡萄酒分析和感官特征的生理潜力提供了初步见解。
一、研究背景与意义
葡萄与葡萄园环境承载着由细菌、酵母和丝状真菌组成的复杂微生物群落。其中，酵母在葡萄与葡萄酒生产中发挥着重要作用，直接影响发酵过程以及终产品的化学和感官特性。葡萄相关酵母群落的组成受多种因素影响，包括地理位置、葡萄品种、气候条件、农业实践和果实成熟阶段等。近年来，全球变暖已成为葡萄栽培中的重大挑战，常导致暖温带地区葡萄汁中糖分过度积累、技术成熟过早以及天然酸度严重流失。尽管酿酒酵母是酒精发酵的主要菌种，但葡萄和酒庄环境中还栖息着更为广泛的酵母多样性。过去几十年中，非酿酒酵母因其代谢多样性和在酿酒及其他生物技术过程中的潜在应用而受到越来越多的关注。这些酵母能够产生酶、有机酸、挥发性化合物及其他代谢产物，可能影响发酵性能和终产品特性。对本土酵母种群的研究不仅有助于理解葡萄园和酒庄环境的微生物生态学，还能鉴定具有潜在有用特性的菌株。然而，尽管对国际葡萄品种已有大量研究，与次要的、本地适应性栽培品种相关的小型本土发酵剂的微生物生态学和酿酒潜力仍鲜有探索。本研究旨在调查意大利中部本土白葡萄品种马塞拉蒂诺及其相关酒庄环境中本土酵母的生物多样性，评估分离株的技术和发酵特性，并通过顺序发酵试验验证其增强酸度管理和香气复杂性的能力。
二、研究内容与主要结论
研究人员从马塞拉蒂诺葡萄和酒庄环境中共收集了163株酵母分离株，其中145株来自葡萄，18株来自环境表面。通过形态学分组和分子鉴定，确认了包括德巴利酵母属、汉逊酵母属、拉钱斯酵母属、梅奇酵母属、毕赤酵母属、星芒酵母属、接合酵母属和酿酒酵母属在内的多种酵母类群。其中酿酒酵母占17%，耐热拉钱斯酵母占14%，双孢接合酵母占11%。时间分布分析显示，汉逊酵母和梅奇酵母主要在直接分离的初始阶段被回收，而拉钱斯酵母、星芒酵母、毕赤酵母、接合酵母和酿酒酵母则主要在自动富集的中后期被分离。
基于分子鉴定结果，研究人员选取了16株代表菌株进行微发酵试验。所有酿酒酵母菌株，包括本土分离株和商业发酵剂，均表现出最高的早期发酵速率，乙醇浓度达到14.75%至16.19%（v/v），残糖低于6 g/L。非酿酒酵母菌种则表现出明显较低的发酵性能，其中耐热拉钱斯酵母活性最高，乙醇浓度达到8.04%至9.05%（v/v），并产生显著的乳酸。基于初步筛选，研究人员选取了4株本土菌株进行顺序发酵试验：酿酒酵母DiSVA 898分别与美极梅奇酵母DiSVA 875、仙人掌汉逊酵母DiSVA 883和耐热拉钱斯酵母DiSVA 890进行顺序接种，以商业酿酒酵母Zinfandel作为参考。
顺序发酵试验结果表明，所有发酵条件最终均达到相当的累计CO2产量和低残糖水平。然而，不同非酿酒酵母菌种在发酵过程中的存活动态存在显著差异：美极梅奇酵母在第7天已不可检测，而仙人掌汉逊酵母和耐热拉钱斯酵母在第7天仍与酿酒酵母共存。在主要分析参数方面，仅耐热拉钱斯酵母DiSVA 890/酿酒酵母DiSVA 898顺序发酵表现出显著且持续的乳酸产生（2.16 g/L）和适度的乙酸增加。
挥发性化合物分析显示，不同顺序发酵策略产生了显著差异的香气特征。耐热拉钱斯酵母顺序发酵以最高浓度的乙酸异戊酯、乙酸乙酯、β-苯乙醇、1-丙醇和异丁醇为特征；仙人掌汉逊酵母顺序发酵则产生最高浓度的丁酸乙酯和异戊醇；美极梅奇酵母顺序发酵与最高浓度的芳樟醇和较高水平的β-苯乙醇相关。主成分分析（PCA）清楚地将不同发酵策略区分开来，证实每种非酿酒酵母在顺序发酵中均产生了独特的挥发性指纹图谱。
感官评价进一步确认了不同发酵策略产生的独特感官特征。耐热拉钱斯酵母顺序发酵酒表现出显著的热带水果和柑橘香气，增强了感知酸度和柔和度，整体平衡性好且酒精感知降低；仙人掌汉逊酵母顺序发酵酒主要与柑橘和香料特征相关，酸度最高；美极梅奇酵母顺序发酵酒则展现出最明显的成熟水果和热带水果特征。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：从意大利科里多尼亚（Corridonia）的有机管理葡萄园和酒庄采集马塞拉蒂诺葡萄样品和环境表面拭子样品；通过直接分离和自动富集两种策略进行酵母分离；利用ITS1-5.8S rRNA-ITS2区域PCR扩增和Sanger测序进行分子鉴定；采用δ12/δ21引物对进行酿酒酵母种内特征分析；开展微发酵试验评估菌株发酵性能；进行纯发酵和顺序发酵试验；采用标准OIV程序分析乙醇、残糖、挥发性酸度和乳酸；使用气相色谱（GC）分析乙醛、乙酸乙酯和高级醇；采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱分析主要挥发性化合物；计算气味活性值（OAVs）；由8名专家评审员进行感官评价；使用方差分析（ANOVA）、Duncan多重范围检验、Tukey HSD检验、线性混合效应模型（LMMs）和主成分分析（PCA）进行统计分析。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究将马塞拉蒂诺葡萄相关本土酵母的生态学特征与所选分离株的技术评价相结合，反映了当前葡萄酒微生物学的趋势，即将本土酵母生物多样性视为功能性特征的重要资源库。研究确认了葡萄浆果相关的典型酵母多样性，其中汉逊酵母和梅奇酵母是新鲜采收葡萄上的优势属。有机管理实践对保护天然酵母群落具有积极作用。非酿酒酵母在混合发酵中作为补充发酵剂的价值在于其能够通过产生酶、有机酸和香气活性代谢物来多样化葡萄酒成分。顺序接种已成为将本土酿酒酵母的发酵稳健性与非酿酒酵母的代谢潜力相结合的最有效策略之一。值得注意的是，非酿酒酵母的持久性与其整体技术影响并无直接关系——美极梅奇酵母在酿酒酵母接种后迅速消失，但仍对葡萄酒香气组成产生了实质性改变，表明早期发酵阶段的短暂代谢活动可能足以重新定向酵母代谢并影响最终挥发性特征。研究结果对暖气候条件下酸度管理具有重要酿酒学意义。
结论部分指出，从马塞拉蒂诺葡萄和酒庄环境中恢复的酵母多样性为在实验室条件下评估混合发酵剂配方提供了宝贵基础。在这些初步试验中，涉及特定本地分离株的顺序发酵产生了独特的挥发性和感官特征。特别是，耐热拉钱斯酵母DiSVA 890的顺序接种因其产生乳酸的特定能力而展现出有前景的技术特性，代表了葡萄汁酸度管理的潜在生物工具。然而，需要跨多个年份的进一步研究和中试规模试验来验证这些本地分离株的稳定性、可重复性和工业可行性，才能对其对区域葡萄酒特征的贡献做出最终结论。
