《Nutrients》：Association of Intestinal Barrier Damage and Mucosal Microbiota Dysbiosis with the TLR4/NF-κB Pathway in High-Salt Diet-Induced Hypertensive Rats
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背景：高盐饮食是高血压的主要危险因素，但肠黏膜微生物群及肠屏障功能障碍的作用仍有待探索。方法：Wistar大鼠分别喂饲正常饮食（OF）和高盐饮食（HSF）33 d以建立高血压。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量血清一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF
背景：高盐饮食是高血压的主要危险因素，但肠黏膜微生物群及肠屏障功能障碍的作用仍有待探索。方法：Wistar大鼠分别喂饲正常饮食（OF）和高盐饮食（HSF）33 d以建立高血压。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量血清一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。采用苏木精-伊红（HE）染色评估肠道和血管的组织病理学变化。采用免疫荧光染色检测紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）表达水平，进一步评估肠屏障损伤。结果：通过16S rRNA测序分析黏膜微生物群。通过实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹（WB）分析TLR4/NF-κB通路激活。HSF大鼠发生高血压并伴显著肠屏障损伤，表现为绒毛自溶以及Claudin-1和ZO-1表达降低。高盐摄入显著抑制有益菌包括Brevibacterium sp. RHS-str. 520和Levilactobacillus brevis的生长，同时促进有害菌如Streptococcus mitis和Nodosilinea nodulosa。相关分析显示，种水平关键差异菌包括Levilactobacillus brevis和Eubacterium tenue与肠道TNF-α蛋白表达及血液TNF-α水平均呈负相关。机制上，高盐饮食激活肠道TLR4/NF-κB通路，上调TLR4、MyD88、p-P65和TNF-α蛋白表达（p < 0.05）。结论：上述发现提示，高盐饮食可能影响肠黏膜微生物群，触发TLR4介导的肠道炎症，并损伤黏膜屏障，最终通过肠黏膜屏障–炎症–血压轴驱动高血压。
研究背景与问题：高盐饮食是高血压最重要的可控危险因素之一。世界卫生组织（WHO）2023年数据显示，多地区平均盐摄入量仍显著高于推荐水平；中国居民膳食指南（2022）推荐成人盐摄入5 g/d，但多项调查显示多个省份日均钠摄入达9.14–11.22 g，接近推荐值两倍。高血压被国际疾病分类归为系统性慢性炎症性疾病，全球影响超过10亿人。肠道黏膜免疫系统是脊椎动物最大的免疫器官，肠黏膜是盐吸收的主要部位。肠道屏障由机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障组成，其中机械屏障主要由上皮细胞和细胞间紧密连接构成，紧密连接蛋白包括Claudin-1、Occludin、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）和连接黏附分子，其表达直接反映肠屏障完整性。高盐饮食可损伤肠屏障，促进细菌移位及细菌产物进入循环，激活全身炎症并诱导高血压；肠道菌群失调也可能参与高血压发病。Toll样受体4（TLR4）是炎症反应与代谢稳态之间的关键分子桥梁，TLR4/MyD88/NF-κB通路介导多种慢性疾病。然而，高盐饮食下肠黏膜微生物群、肠黏膜屏障功能、TLR4/NF-κB通路与高血压之间的关系尚需探索。研究人员通过高盐饮食建立大鼠高血压模型，检测肠黏膜微生物群、肠黏膜屏障、TLR4/NF-κB通路蛋白及血液指标，初步探讨高盐诱导肠屏障损伤参与高血压的可能机制，为后续研究提供实验依据。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用SPF级雄性Wistar大鼠，6周龄，体重150 ± 10 g，购自北京华福康生物科技有限公司，饲养于湖南中医药大学实验动物中心。大鼠随机分为正常对照组（OF）和高盐诱导高血压组（HSF），分别给予标准饲料和含8%氯化钠（NaCl）的高盐饲料33 d。采用尾袖体积记录法测量收缩压（SBP）和舒张压（DBP）；采用ELISA检测血清NO和TNF-α；采用HE染色观察肠道和血管病理；采用免疫荧光检测Claudin-1、Occludin和ZO-1；采用RT-qPCR和WB检测TLR4/NF-κB通路；采用16S rRNA测序分析肠黏膜微生物群，结合LEfSe和随机森林分析筛选特征菌，并进行Spearman相关分析。高盐组因盐抵抗排除4只，最终每组6只用于分析。
研究结果：
3.1 高盐饮食诱导大鼠高血压：通过尾袖法测压，HSF组从高盐饮食第2天至第23天SBP和DBP逐渐升高，第5天SBP和DBP显著高于OF组（p < 0.01，p < 0.05），第12天无显著差异（p > 0.05），第26–30天HSF组血压显著高于OF组（p < 0.001），提示已形成稳定高血压。
3.2 高盐饮食对大鼠摄食和体重的影响：HSF组摄食量出现波动，第一周显著低于OF组（p = 0.023），第二周恢复至与OF组无显著差异；第四周起HSF组体重显著低于对照水平（p = 0.0012），提示高盐饮食后期不影响食欲但显著降低体重，同时升高血压。
3.3 血液TNF-α和NO水平升高：ELISA显示，HSF组血清TNF-α为103.303 pg/mL，显著高于OF组32.77 pg/mL（p = 0.0009）；HSF组血清NO为12.41 pg/mL，显著高于OF组1.98 pg/mL（p = 0.027）。
3.4 对肾、肝、脾指数的影响：高盐饮食显著增加肾脏质量，HSF组肾指数显著高于OF组（p < 0.0001）；肝指数和脾指数两组无显著差异（p > 0.05），提示高盐饮食主要影响肾脏。
3.5 肠道和血管HE染色结果：肠道HE染色显示，OF组黏膜层绒毛丰富、排列整齐，上皮细胞无明显脱落，固有层小肠腺形态规则、排列紧密；HSF组肠绒毛顶端自溶、黏膜结构不完整，提示肠屏障损伤。血管HE染色显示，OF组血管结构清晰，内弹性膜呈清晰波浪状；HSF组动脉外膜可见局部红细胞外渗，提示高盐饮食诱导高血压大鼠亦发生血管损伤。
3.6 高盐饮食诱导大鼠肠屏障损伤：形态学显示HSF组绒毛高度（VH）降低、隐窝深度（CD）变浅、杯状细胞数减少、上皮长度（EL）缩短；HSF组EL显著低于OF组（p = 0.0003）。单位长度杯状细胞数HSF组高于OF组，但差异无统计学意义。VH和EL同时降低提示黏膜表面积显著减少，高盐摄入损害肠上皮再生能力和稳态更新；杯状细胞减少提示化学屏障功能受损。免疫荧光显示，HSF组Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白表达与OF组无显著差异（p > 0.05），结合VH、CD和EL显著形态学改变，提示高盐饮食可能对肠机械屏障产生潜在影响，但仍需进一步实验验证。
3.7 高盐饮食对大鼠肠道MyD88通路的影响：RT-qPCR显示，HSF组肠道MyD88、P65和TLR4相对mRNA表达高于OF组，其中MyD88相对表达显著高于OF组（p = 0.0016）。WB显示，HSF组TLR4（p = 0.0007）、MyD88（p = 0.0013）、p-P65（p < 0.0001）和TNF-α（p = 0.0011）蛋白表达显著高于OF组；IL-6蛋白两组无显著差异（p > 0.05），但HSF组高于OF组。结果提示高盐饮食诱导大鼠肠道MyD88通路相关基因和蛋白表达改变，从而激活该通路。
3.8 高盐饮食对大鼠肠道黏膜微生物的影响：
3.8.1 对肠黏膜微生物多样性和组成的影响：HSF组ASV数量低于OF组，分别为2321和3278，两组共享ASV为28。α多样性和β多样性显示，两组肠黏膜微生物丰富度和均匀度无显著差异，但分布存在差异。门水平上，Bacillota、Bacteroidetes、Pseudomonadota和Actinomycetota为两组共同优势门；Bacillota、Pseudomonadota和Actinomycetota相对丰度OF组高于HSF组，Cyanobacteriota仅存在于HSF组。属水平前10为Clostridium、Bacteroides、Streptococcus、Prevotella、Nodosilinea、Blautia、Parabacteroides、Pediococcus、Xanthomonas和Ligilactobacillus；Clostridium和Xanthomonas在OF组高于HSF组，Bacteroides、Blautia、Streptococcus在HSF组高于OF组，其中Blautia和Streptococcus在OF组显著低于HSF组（p < 0.05）；Nodosilinea仅存在于HSF组，属有害菌；Xanthomonas仅存在于OF组。种水平前10包括Bacteroides sp.、Clostridium sp. CYP4、Clostridium phoceensis、Clostridium sp. mbf VZ 132、Streptococcus mitis、Nodosilinea nodulosa、Parabacteroides distasonis、Pediococcus pentosaceus、Blautia wexlerae和Xanthomonas sp. EBHRSOI-2；Clostridium sp. CYP4、Parabacteroides distasonis、Pediococcus pentosaceus和Xanthomonas sp. EBHRSOI-2在OF组相对丰度高于HSF组，Bacteroides sp.和Clostridium phoceensis在OF组较低；Streptococcus mitis和Nodosilinea nodulosa仅存在于HSF组；Xanthomonas sp. EBHRSOI-2仅存在于OF组，为潜在有益共生菌。属和种水平结果提示高盐饮食抑制有益肠黏膜细菌生长，导致肠黏膜微生物群失调。
3.8.2 肠黏膜特征微生物：LEfSe分析和随机森林分析用于识别OF与HSF组关键差异肠黏膜细菌。两组共有29个特征微生物，包括9个种、10个属、5个科、4个目和1个纲。结合LEfSe和随机森林分析，10个差异属中6个在随机森林中具有显著影响值，均为OF组优势属，即Paeniclostridium、Lactobacillus、Romboutsia、Acidovorax、Pseudalkalibacillus和Brevibacterium；种水平上9个差异种中6个在随机森林模型中具有高影响值，均为OF组优势种，即Eubacterium tenue、Levilactobacillus brevis、Clostridium sp. CYP4、Brevibacterium sp. RHS-str.520、Acidovorax sp. PD-10和Pseudalkalibacillus hwajinpoensis。
3.9 相关分析：
3.9.1 肠道微生物群与血液指标的相关分析：关键差异菌与血清NO和TNF-α相关分析显示，属水平Brevibacterium、Acidovorax和Paeniclostridium与NO显著负相关（p < 0.01，p < 0.05），Acidovorax和Paeniclostridium与TNF-α显著负相关（p < 0.05）。种水平Brevibacterium sp. RHS-str.520、Acidovorax sp. PD-10、Eubacterium tenue和Levilactobacillus brevis与NO显著负相关（p < 0.01，p < 0.05），Acidovorax sp. PD-10、Eubacterium tenue和Levilactobacillus brevis与TNF-α显著负相关（p < 0.05）。这些关键差异属和种均为对照组优势微生物，高盐饮食抑制这些关键差异微生物，导致血液NO和TNF-α水平改变。
3.9.2 肠道微生物群与肠黏膜蛋白表达的相关分析：关键差异菌与肠道MyD88通路相关蛋白表达相关分析显示，属水平Paeniclostridium和Acidovorax与p-P65显著负相关（p < 0.05），Brevibacterium、Paeniclostridium和Acidovorax与TLR4蛋白表达显著负相关（p < 0.05）。种水平Acidovorax sp. PD-10、Eubacterium tenue和Levilactobacillus brevis与p-P65蛋白表达显著负相关（p < 0.05）；Brevibacterium sp. RHS-str.520、Eubacterium tenue和Levilactobacillus brevis与TNF-α蛋白表达负相关（p < 0.05，p < 0.01），Acidovorax sp. PD-10与TLR4蛋白表达显著负相关（p < 0.01）。结果提示，属水平Paeniclostridium和Acidovorax，以及种水平Acidovorax sp. PD-10、Eubacterium tenue、Levilactobacillus brevis和Brevibacterium sp. RHS-str.520可能与MyD88通路激活相关。结合关键差异菌与血清和肠道蛋白表达分析，种水平关键差异菌Eubacterium tenue和Levilactobacillus brevis与肠道TNF-α蛋白表达及血液TNF-α水平均显著相关，可能为参与高盐饮食诱导高血压反应的关键差异菌，其功能作用有待通过粪菌移植或无菌动物定植等进一步研究。
讨论部分总结：研究人员发现，大鼠高盐饮食4周后形成稳定高血压，并伴尿量显著增加和肾指数升高。血液指标显示高盐组血清NO和TNF-α水平显著高于正常大鼠。HSF组血清NO升高可能代表对血压升高的代偿反应，但由于未直接检测血管或肠道组织中iNOS和eNOS表达，仍需进一步研究区分其反映慢性炎症还是内皮反应。尿量与肾功能相关，尿量和肾指数显著增加提示高盐饮食引起肾脏代偿性增生和肥大，导致早期病理改变。高盐饮食和高血压均是肾损伤危险因素，涉及肾素–血管紧张素–醛固酮系统（RAAS）激活、氧化应激和低度炎症。TLR4作为模式识别受体，不仅参与感染免疫和损伤诱导炎症反应，也参与代谢相关疾病和生理代谢调节。RT-qPCR和WB结果显示，与OF组相比，高血压大鼠肠黏膜MyD88相对mRNA表达显著增加，TLR4、MyD88、p-P65和TNF-α蛋白表达显著升高。这些基因和蛋白层面结果提示高盐饮食干扰肠道TLR4/NF-κB信号级联的多个节点：上游高盐挑战升高MyD88表达，促进信号从细胞表面受体向胞内衔接分子转导；下游p65磷酸化增强促进NF-κB核转位，驱动TNF-α促炎介质转录。TNF-α作为级联中的早期应答促炎介质，可进一步放大炎症信号并诱导次级IL-6产生，形成肠黏膜组织内正反馈炎症环。本研究中仅TNF-α在肠组织蛋白水平出现统计学显著升高，肠道IL-6蛋白未达显著差异，这在高盐诱导肠道炎症动物模型中并不罕见，可能归因于干预时长和大鼠品系特异性炎症表型差异。结合外周血循环TNF-α升高，数据提示高盐诱导的肠道TLR4/NF-κB信号激活可能部分促成全身炎症因子水平升高。炎症是复杂自限过程，当自限性调控异常时转变为有害慢性炎症状态，即慢性低度炎症，而该过程对高血压发展至关重要。结合肠机械屏障和免疫荧光染色结果，高盐饮食导致EL显著降低，Claudin-1和ZO-1蛋白表达呈下降趋势，并出现绒毛顶端自溶和黏膜结构不完整。因此，高盐饮食可能对肠机械屏障产生潜在影响。综合这些发现，高盐饮食可能损伤肠屏障完整性，进而可能激活肠道模式识别受体并改变下游炎症因子蛋白表达，从而促成循环炎症细胞因子水平升高，使机体维持长期低度炎症状态，可能参与高血压发展。肠黏膜优势菌和关键差异菌结果显示，高盐饮食在属和种水平显著抑制有益菌，包括Clostridium、Lactobacillus、Acidovorax和Brevibacterium等属，以及Ligilactobacillus、Eubacterium tenue和Levilactobacillus brevis等种，同时促进有害菌Nodosilinea生长。Clostridium属大多为非致病菌，多数可水解糖和蛋白质，例如丁酸梭菌可促进有益菌双歧杆菌和乳杆菌生长，同时抑制病原菌，调节肠道健康。本实验中OF组Clostridium相对丰度高于HSF组。Lactobacillus为肠道益生菌，可在肠道产生短链脂肪酸和γ-氨基丁酸（GABA），促进肠道健康并降低血压；产GABA的Lactobacillus可能有益于治疗肠功能障碍。Ligilactobacillus是Lactobacillus的亚属，作为有益菌可刺激免疫细胞分泌抗过敏相关细胞因子。本实验肠道微生物群结果提示，高盐饮食损伤肠屏障，导致细菌失调，抑制有益菌生长并促进有害菌增殖。与血液指标和TLR4/NF-κB通路下游蛋白表达相关的关键差异菌分析显示，OF组种水平Brevibacterium sp. RHS-str.520和Levilactobacillus brevis与血清TNF-α及MyD88通路中TNF-α蛋白表达显著负相关，提示这两种菌可能与高盐饮食诱导高血压中的TNF-α产生相关。种水平Acidovorax sp. PD-10、Eubacterium tenue、Levilactobacillus brevis和Brevibacterium sp. RHS-str.520可能与MyD88通路激活相关。Majid等证明高盐饮食可诱导TNF-α产生，后者激活其受体1型发挥利钠效应；本研究结果提示该效应可能与高盐饮食介导的Brevibacterium sp. RHS-str.520和Levilactobacillus brevis抑制有关。这可能激活TLR4/NF-κB通路并上调下游TLR4、MyD88、p-P65和TNF-α蛋白水平，进一步升高血清TNF-α，可能促成慢性低度炎症和高血压发展。
结论翻译：总之，高盐饮食可能损害大鼠肠黏膜屏障，表现为绒毛顶端自溶、上皮细胞脱落、绒毛高度降低、上皮长度显著缩短和隐窝深度减少，这可能导致肠道通透性增加。同时，高盐饮食抑制关键差异菌Brevibacterium sp. RHS-str. 520和Levilactobacillus brevis的生长。这可能使病原菌穿过受损肠屏障并被TLR4受体感知。这种识别可能触发TLR4/NF-κB炎症级联，促成炎症细胞因子释放。这些改变可能导致大鼠慢性低度炎症，并可能与高血压发展相关。总体而言，这些机制解释来自本研究发现的相关性分析，未来仍需直接实验证据。
局限性：本研究为观察性研究，未使用通路特异性抑制剂或基因敲除模型进行机制验证；未检测肠道微生物代谢物（如短链脂肪酸）；实验周期相对较短且样本量有限；每组6只动物，统计功效有限，因此未进行多重检验校正，所有差异菌和相关性发现应视为探索性。未来需通过药理学干预或遗传学方法、代谢组学与微生物组数据整合、更长周期监测和更大队列进一步验证。
