整合网络药理学、多组学与机器学习探索党参（Codonopsis pilosula）在山地病中的潜在分子机制

《International Journal of Molecular Sciences》：Integrative Multi-Omics and Network Pharmacology Analyses Reveal Potential Mechanisms of Codonopsis pilosula in Mountain Sickness

　　

山地病（mountain sickness）包括与低气压缺氧（hypobaric hypoxia）相关的一系列高原疾病，包括急性高山病（acute mountain sickness, AMS）和高原肺水肿（high-altitude pulmonary edema, HAPE）。尽管党参（Codonopsis pilosula）在传统医学中已被广泛用于与缺氧相关的病症，但其在山地病中的分子基础仍知之甚少。在此，研究人员整合了网络药理学（network pharmacology）、转录组分析（transcriptomic analysis）、基于机器学习的特征选择（machine-learning-based feature selection）、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）和分子对接（molecular docking），以探索党参相关候选靶点与山地病之间的潜在分子关联。研究人员鉴定了一组党参相关候选靶点，其富集于与缺氧应答、氧化应激、炎症和血管调节相关的生物学过程。跨高海拔暴露、AMS和HAPE的整合转录组分析揭示了免疫相关和氧转运相关程序的趋同改变。机器学习分析进一步为与高海拔暴露相关的候选基因提供了内部计算优先级排序，并在所分析配对队列中通过互补算法反复选择。单细胞转录组分析为这些候选基因提供了额外的细胞背景，揭示了外周血和肺细胞群中不同的表达模式。分子对接进一步鉴定了所选党参化合物与候选蛋白之间的潜在相互作用，其中MMP9、CA2和BCL2显示出相对有利的预测相互作用。总之，这些发现为评估党参相关候选靶点与高海拔缺氧的转录和细胞反应之间的潜在关联提供了一个探索性框架，并鉴定了供进一步实验研究的候选分子通路和靶点。

研究人员围绕党参（Codonopsis pilosula）与山地病（mountain sickness）的潜在分子关联开展整合研究。高海拔环境因大气压降低和氧可利用性下降而对人体造成显著生理挑战；当人体对低气压缺氧（hypobaric hypoxia）适应不足时，可出现包括急性高山病（acute mountain sickness, AMS）、高原肺水肿（high-altitude pulmonary edema, HAPE）及其他严重高海拔并发症在内的疾病谱。这些疾病涉及氧稳态受损、氧化应激失衡、炎症激活、免疫失调和血管功能障碍等复杂病理过程。党参含有多糖、皂苷、甾醇、多炔和倍半萜等多种生物活性成分，具有抗氧化、抗炎和免疫调节等作用，部分成分显示抗缺氧活性，可调节缺氧条件下的氧化应激、线粒体代谢和免疫反应。然而，党参在高海拔相关疾病中的分子机制仍 largely 未解，尤其是其可能影响不同缺氧相关病症的共同调控网络和关键分子节点尚未被系统刻画。山地病并非单一病理状态：高海拔暴露是环境挑战，可在健康个体中诱导生理适应，而AMS和HAPE是与低气压缺氧适应不良相关的不同临床表现。传统网络药理学（network pharmacology）多依赖预测的化合物-靶点相互作用和数据库信息，对候选靶点的细胞情境和生物学相关性解析有限。因此，研究人员建立整合框架，联合网络药理学、转录组分析、机器学习特征选择、单细胞RNA测序和分子对接，系统整合高海拔暴露、AMS和HAPE相关转录组改变，考察其与党参相关候选靶点的重叠，并对候选基因进行优先排序和细胞分布刻画，最终生成假设供后续实验验证。该研究的意义在于提供一个系统级、假设生成的框架，以优先化党参与山地病之间潜在分子关联，并鉴定候选通路和靶点。

关键技术方法：网络药理学（network pharmacology）采用口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%和类药性（drug-likeness, DL）≥0.18筛选TCMSP中党参成分，整合TCMSP与HERB靶点；从GeneCards和OMIM获取山地病相关基因。转录组数据来自GEO：GSE103940含11名受试者高海拔暴露前后22份配对血样；GSE75665含10名受试者重复测量，包括5例AMS和5例非AMS，每名受试者在平原和高海拔条件下采样；GSE260910含6例HAPE患者和6例对照。单细胞参考数据GSE134355包括外周血和肺。机器学习在GSE103940上进行受试者级留一法（leave-one-subject-out, LOSO）等内部验证。分子对接使用AutoDock Vina和PDB受体结构。

研究结果如下。

2.1 党参候选化合物与靶基因：基于OB和DL阈值保留21个候选化合物，整合数据库后获得398个推定靶基因；从GeneCards和OMIM收集351个山地病相关基因；交集分析获得54个共享候选靶点。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络，并导入Cytoscape进行网络优化和拓扑分析，以节点度评估靶点相对重要性。功能富集显示这些靶点参与HIF-1信号通路、炎症反应、白细胞介素-4和白细胞介素-13信号、氧化应激反应以及循环系统血管调节等。NR3C2基因编码的盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor, MR）被报道在HAPE血管张力调节中起关键作用，MMP2可能参与高海拔缺氧下肺结构重塑。结论是重叠候选靶点主要关联缺氧应答、炎症、氧化应激和血管调节，为后续研究提供假设生成基础。

2.2 高海拔暴露中党参相关靶基因：利用GSE103940配对血样比较高海拔暴露前后转录组，共鉴定2782个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），包括118个上调和2664个下调基因，阈值为校正p < 0.05且|log₂FC| > 1.5。上调基因主要富集于血小板衍生生长因子受体信号通路负调控和红细胞分化；下调基因显著富集于DNA和mRNA代谢过程、核糖核蛋白复合体生物发生、淋巴细胞中miRNA靶基因以及T细胞分化。将54个候选基因与高海拔暴露失调转录本交集，发现SNCA位于上调基因，NR3C2、BCL2、HIF1A、CXCL8、ABCB1、FCER2和ATM位于下调基因。单细胞参考图谱显示主要外周血细胞群包括CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞和红系谱系细胞；SNCA在红系谱系细胞中优先表达，BCL2和ABCB1在CD4⁺ T细胞群中表达相对较高。结论是高海拔暴露与红系相关改变以及免疫和转录相关基因程序表达降低有关，并为候选基因提供细胞背景。

2.3 与高原肺水肿相关的党参候选靶基因：HAPE受试者与对照比较获得477个DEGs，包括63个上调和414个下调基因。下调基因显著富集于T细胞相关通路，包括T细胞激活、T细胞受体信号以及Th1、Th2和Th17细胞亚群分化，该模式与高海拔暴露高度一致，提示T细胞介导免疫应答改变可能是高海拔适应和疾病进展的共同特征。上调基因主要关联呼吸适应相关过程，包括二氧化碳转运、血红蛋白复合体形成和氧转运。基于失调基因构建PPI网络，发现CA2、BCL2、ABCB1和NR3C2等候选靶基因处于中心位置，并与IL7R、IL2RB和IL24等免疫相关基因广泛互作。这些基因在HAPE与对照间差异表达：CA2（log₂FC = 1.63，p = 0.023）、BCL2（log₂FC = ?1.50，p = 0.0006）、ABCB1（log₂FC = ?1.74，p = 0.0004）和NR3C2（log₂FC = ?1.84，p = 0.0003）。肺单细胞参考图谱显示CA2表达较广，在肺细胞、巨噬细胞和上皮细胞中较高；NR3C2在肺细胞和内皮细胞群中可检测。结论是这些结果为党参相关靶点与HAPE中气体交换、免疫调节、血管屏障完整性及肺上皮-内皮功能之间提供候选分子和细胞情境。

2.4 机器学习对高海拔暴露相关候选基因的优先排序：对预定义54个候选基因中39个表达合格基因应用四种互补机器学习算法。受试者级留一法外层预测显示，LASSO的ROC-AUC为0.942（95% CI，0.835–1.000），Elastic Net为0.992（95% CI，0.967–1.000），Random Forest为0.983（95% CI，0.934–1.000），SVM-RFE为1.000（95% CI，1.000–1.000）。相应平衡准确度、敏感度和特异度分别为LASSO 0.909、1.000、0.818；Elastic Net、Random Forest和SVM-RFE为0.955、1.000、0.909。所有AUC均超过配对标签置换分布，提示在该配对队列内部可区分基线与高海拔暴露样本，但仅为内部受试者级验证。特征选择稳定性显示，LASSO重复选择ATM、SNCA和BCL2；Random Forest优先ATM、SNCA、CA2、BCL2、APP、HBB和GATA1；SVM-RFE稳定性分析突出SNCA、ATM、HBB、BCL2、APP、FCER2、CA2和GATA1；Elastic Net也高频率选择若干重叠候选。按预设选择频率阈值0.60取交集，ATM、SNCA和BCL2被四种方法支持，归为Tier 1候选；APP、HBB、CA2和GATA1被三种方法支持，归为Tier 2候选。结论是跨算法反复选择应解释为内部计算优先排序，而非独立生物学验证。

2.5 分子对接分析：对NR3C2、MMP9、CA2和BCL2进行分子对接并使用已验证受体结构和重对接对照。受体结构为NR3C2（PDB ID：2AA2；A链；分辨率1.95 ?；口袋由醛固酮/AS4定义）、MMP9（PDB ID：1GKC；A链；分辨率2.30 ?；口袋由NFH定义）、CA2（PDB ID：5E28；A链；分辨率1.30 ?；口袋由BC5定义）和BCL2（PDB ID：8HTS；A链；分辨率1.25 ?；口袋由N2L定义）。重对接重现参考配体构象，最高姿态RMSD分别为0.064、1.362、0.504和0.339 ?。在该方案下，stigmasterol（MOL000449）、spinasterol（MOL004355）和stigmasterone（MOL008407）对NR3C2预测亲和力较弱；luteolin（MOL000006）对MMP9预测相互作用较有利（?9.619 kcal/mol），3-beta-Hydroxymethyllenetanshiquinone（MOL007059）对CA2为?8.706 kcal/mol，capsaicin对BCL2为?7.271 kcal/mol。结论是MMP9、CA2和BCL2显示出相对有利的预测相互作用。

讨论部分总结：研究人员整合网络药理学与高海拔暴露、AMS和HAPE转录组分析，并联合机器学习候选优先排序、单细胞转录组映射和分子对接。网络药理学候选靶点富集于缺氧信号、氧化应激、炎症和血管调节，反映党参多组分、多过程特征；由于所有转录组数据集均未涉及党参或其成分处理，这些重叠应解释为间接、假设生成的关联，而非治疗诱导转录效应证据。转录组分析突出免疫相关程序改变，尤其是T细胞激活和分化，在高海拔暴露和HAPE中均出现；HAPE还显示氧和二氧化碳转运相关过程增加，符合低气压缺氧生理需求。基于标记的批量血转录组分析提示循环细胞组成变化可能贡献这些模式，因此免疫相关改变可能反映细胞组成与转录反应的组合。NR3C2在网络和转录组中反复出现，并在肺细胞和内皮细胞中可检测，其编码的盐皮质激素受体与血管稳态、炎症调节和氧化应激反应有关。CA2与HAPE相关转录改变相关并在肺细胞群中表达较广；BCL2被转录组和机器学习反复优先并在CD4⁺ T细胞群中表达较高。HBB和SNCA在红系谱系细胞中优先表达，与红系适应相关。机器学习在小型配对队列中反复选择ATM、SNCA和BCL2等，但缺乏独立外部验证，因而仅为内部候选优先排序。探索性共表达分析因网络拟合差且模块-AMS关联经多重检验校正后不显著，仅作描述，不用于候选优先或机制推断。分子对接提供化合物-蛋白结构预测，但不确立生化结合、效力、疗效或下游活性。总体而言，这些发现支持党参潜在分子关联分布于若干相互连接的生物过程，而非集中于单一靶点，涉及缺氧应答、氧转运、免疫调节、氧化应激以及肺血管或上皮功能，并跨越红系、免疫、上皮、肺细胞和内皮等细胞区室。

研究结论翻译：本研究提供了一个系统级、假设生成框架，用于考察党参（Codonopsis pilosula）与山地病（mountain sickness）之间潜在分子关联。通过整合网络药理学（network pharmacology）与高海拔暴露、急性高山病（AMS）和高原肺水肿（HAPE）的转录组分析，研究人员优先了与缺氧应答、免疫调节、红系适应、氧化应激和肺功能相关的候选基因和生物过程。机器学习分析进一步优先了反复出现的候选基因，单细胞转录组映射提供了细胞背景，分子对接产生了预测的化合物-蛋白相互作用。这些发现应被解释为计算生成的假设，而非治疗效果或实验确立机制的证据。需要进一步的生化结合实验、相关细胞模型、扰动研究和体内验证，以确定优先化合物和候选基因是否在高海拔缺氧或山地病中具有功能角色。