马克氏克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）细胞外囊泡作为生物活性化合物新型递送系统的表征研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Characterization of Kluyveromyces marxianus Extracellular Vesicles as a New Potential Delivery System for Biologically Active Compounds

　　

益生微生物释放的细胞外囊泡（细胞外囊泡，Extracellular Vesicles，EVs）可能通过将其货物转移至其他细胞而参与细胞间通讯。因此，将其作为药物递送系统应用的研究兴趣日益增长。本文报道了在标准生长条件及模拟胃肠道环境的液体中对三株马克氏克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）（B0399、WUT240和WUT216）所分泌细胞外囊泡的研究。纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）揭示出球形细胞外囊泡，其众数直径范围为79.8至148.2 nm，具体取决于生长条件。在人肠道细胞系上进行的研究未发现细胞外囊泡的细胞毒性效应。此外，细胞外囊泡在正常细胞中表现出温和的抗氧化特性。K. marxianus细胞外囊泡在HT-29模型中未刺激促炎细胞因子IL-8的释放，但在大蜡螟（Galleria mellonella）血细胞中诱导了定制化的免疫调节反应，其特征为IL-8样蛋白水平升高而TNF-α样反应缺失。蛋白质组学分析鉴定出所有菌株共有的161种核心蛋白，其中筛选出33种与人类蛋白无显著同源性的潜在生物标志物，这将有助于在后续研究中追踪酵母细胞外囊泡载体。此外，研究发现酵母细胞外囊泡对人细胞具有高亲和力，可将生物活性分子（阿霉素）和尼罗红染料转运至受体细胞中。综上所述，本研究提供了明确证据，表明K. marxianus的细胞外囊泡可被视为一种药物递送系统。

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一、研究背景与目的

益生菌的概念已超越世界卫生组织的传统定义，其潜在应用现已涵盖作为生物活性化合物的载体。以活菌为基础的药物递送系统虽具备生物相容性好、毒性低及与宿主组织相互作用等优势，但也存在对抗菌或抗真菌药物敏感、可能在免疫力低下患者中引发血流感染等局限性。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）作为非活体药物递送系统有望克服上述问题。已有研究表明，益生细菌和酵母释放的EVs可与其他细胞相互作用，在体外细胞模型和体内动物模型中发挥免疫调节、改善代谢紊乱、促进肠道健康及抗微生物和病毒感染等积极作用。然而，EVs在临床应用中仍面临诸多技术挑战，包括不同分离方法导致的组成和产量差异、制剂中存在的因子和污染物，以及缺乏合适的临床前研究模型等，因此对其潜在应用进行探索之前，有必要对EVs进行详细表征。

马克氏克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）的某些菌株表现出益生特性，包括强抗氧化活性、抑制白色念珠菌（Candida albicans）及曲霉属（Aspergillus）和镰刀菌属（Fusarium）霉菌生长的能力，并能够调节宿主免疫反应。由于活体K. marxianus常被人类食用（例如开菲尔），推测其在摄入后可能通过其EVs与肠道细胞相互作用，但目前仍缺乏支持这一假说的证据。本研究旨在探究K. marxianus来源的EVs是否能在体外将生物活性分子转运至人肠道细胞中，为此选用了三株已知菌株——B0399（商业益生菌）、WUT240和WUT216（分别分离自发酵马奶和牛奶）。

二、研究内容与主要结论

研究人员首先对三株K. marxianus在标准培养基（SAB）及模拟人体胃肠道环境液体（胃液SGF、小肠液SIF、结肠液SCF）中产生的EVs进行了全面表征。透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察显示EVs为球形结构，具有明显的深色染色模式，间接表明脂质双层的存在；DiO染料染色结合纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）荧光模式进一步确认了样品中膜结构的存在。在SAB培养基中，B0399、WUT240和WUT216菌株产生的EVs众数直径分别为107.5 ± 2.39 nm、115.2 ± 5.98 nm和97.3 ± 2.49 nm，平均直径分别为144.3 ± 2.55 nm、148.2 ± 2.76 nm和136.0 ± 3.61 nm，其中WUT240菌株产生的颗粒最大。三株菌在SAB培养基中的EVs浓度分别为1.08 × 10¹⁰ ± 1.85 × 10⁹ EVs/mL（B0399）、2.01 × 10¹⁰ ± 7.11 × 10⁹ EVs/mL（WUT240）和5.01 × 10¹⁰ ± 2.07 × 10¹⁰ EVs/mL（WUT216）。

质谱蛋白质组学分析在B0399、WUT240和WUT216的EVs中分别鉴定出504、354和220种蛋白质，其中190种为B0399特有，48种为WUT240特有，13种为WUT216特有，三株菌共有蛋白为161种。基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析显示，约31%的共有蛋白属于细胞质核糖体，约18%为细胞膜蛋白，约9%属于胞外区域蛋白；约35%的蛋白与细胞质翻译相关，另有大量蛋白参与碳水化合物代谢。在分子功能方面，约63%的蛋白具有催化活性，此外还涉及RNA结合、杂环化合物结合和核糖体结构组成等功能。研究人员从共有蛋白中筛选出33种与人类蛋白无显著同源性的潜在生物标志物，这些蛋白主要参与碳水化合物代谢（如Hxk1、Lac4、Inu1、Icl1、Mls1、Pck1、Xyl1-2和Aaap1）、细胞壁重塑（如Exg1、Gas1、Gas3、SCW4、SUN4、SIM1和Crh2）以及eisosome形成（Pil1和Lsp1），可用于后续研究中通过免疫学技术特异性追踪酵母EVs在人细胞内的定位。

在模拟胃肠道环境的研究中，三株菌在SGF、SIF和SCF中分别孵育1、2和24 h后，EVs的尺寸分布与各自对照相比无显著差异，但多数情况下肠道液体中收集的EVs平均直径略大。以每个细胞产生的EVs数量计算的特定EVs生产率方面，除WUT240在SGF对照组中出现一次统计学显著的突发性释放外，暴露于人工消化液未导致特定生产率的显著变化，但总体趋势显示模拟胃肠道条件略微降低EVs生产率。相比之下，以每毫升培养液总EVs产量计算时，SGF（1 h）和SIF（2 h）处理导致B0399和WUT240菌株的总EVs释放量较对照显著下降，WUT216也呈现类似趋势；而在SCF中孵育24 h后，三株菌的总EVs产量均接近对照水平。

在功能效应评估中，研究人员选用SAB和SCF培养基中收集的EVs，对五种人肠道细胞系（三种癌细胞系HT-29、HCT 116、Caco-2和两种正常细胞系CCD-18Co、CCD 841 CoN）进行了代谢活性（MTT法）和活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平检测。结果表明，在10²–10⁴ EVs/细胞的浓度范围内未观察到明显的剂量依赖性效应。SAB来源的EVs对癌细胞系（特别是Caco-2和HCT 116）的代谢活性有一定抑制作用，但细胞活力始终保持在70%细胞毒性阈值以上；SCF来源的EVs则通常维持或略微增强癌细胞系的代谢活性。在正常细胞系中，部分处理（特别是B0399在SAB中以及WUT240和WUT216在SCF中产生的EVs）引起了统计学显著的代谢刺激效应，但增幅仅为约10–25%，生物学影响有限。在ROS水平方面，EVs对正常细胞始终表现出抗氧化效应，将ROS水平降低至对照阈值以下，效果与谷胱甘肽（GSH）类似；对癌细胞的影响则高度依赖于菌株和细胞系，其中在HCT 116细胞中，B0399和WUT240来源的EVs在低浓度（10²–10³）下表现出明显的促氧化活性，将ROS水平提升约130–210%，而WUT216的EVs则发挥轻微抗氧化作用。

免疫原性评估方面，在HT-29细胞模型中，经B0399、WUT240和WUT216 EVs处理24 h后，IL-8水平分别为170.83 ± 3.82 pg/mL、171.51 ± 3.50 pg/mL和173.19 ± 3.25 pg/mL，与未处理对照（174.19 ± 2.42 pg/mL）无显著差异，而脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）阳性对照则显著升高至222.63 ± 2.70 pg/mL，表明K. marxianus EVs不会诱导HT-29细胞释放促炎细胞因子IL-8。在大蜡螟（Galleria mellonella）血细胞模型中，免疫荧光定量分析显示，WUT216和WUT240 EVs处理组的IL-8样蛋白校正荧光强度（分别为21.7 ± 2.1 a.u.和19.9 ± 3.2 a.u.）与LPS刺激组（21.4 ± 2.4 a.u.）相当，均显著高于未处理组（6.4 ± 0.1 a.u.）和PBS处理组（5.9 ± 0.3 a.u.）；而TNF-α样蛋白方面，EVs处理组（WUT216为5.7 ± 0.3 a.u.，WUT240为5.1 ± 0.5 a.u.）与阴性对照组无显著差异，仅LPS组（16.4 ± 0.4 a.u.）显著升高。这表明K. marxianus EVs选择性诱导IL-8样蛋白而非TNF-α样蛋白的表达，具有独特的免疫调节特性。

在递送系统验证方面，荧光显微镜观察显示，经尼罗红（Nile Red，NR）标记的K. marxianus EVs在15分钟内即可与人肠道细胞系发生强烈相互作用或被细胞内化，而对照样品无红色荧光信号，确认游离染料已完全去除。进一步的阿霉素（Doxorubicin，DOX）递送实验表明，无论是游离DOX还是包封于EVs中的DOX（B0399-DOX、WUT240-DOX和WUT216-DOX），在孵育1小时后均能在Caco-2细胞核内观察到明显的药物积累，且DOX在细胞核内的存在降低了DAPI与DNA嵌入的效率，表现为蓝色荧光强度减弱。

三、关键技术与方法

本研究采用了以下主要技术方法：（1）EVs分离纯化：通过差速离心去除酵母细胞，0.2 μm无菌PES真空过滤器过滤上清液，随后使用100 kDa再生纤维素离心过滤器进行浓缩和PBS洗涤；（2）EVs表征：采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定EVs的尺寸分布和浓度，透射电子显微镜（TEM）观察形态；（3）蛋白质组学分析：通过质谱鉴定EVs蛋白组成，以NCBI数据库中K. marxianus（15,588条序列）为参考进行匹配，利用g:Profiler进行GO富集和KEGG通路分析，并通过BLASTP搜索筛选与人类蛋白无同源性的潜在生物标志物；（4）细胞功能评估：采用MTT法检测代谢活性，dcFDA荧光探针检测ROS水平，ELISA检测IL-8分泌；（5）免疫荧光检测：在大蜡螟血细胞中通过免疫荧光染色和校正荧光强度定量分析IL-8样和TNF-α样蛋白水平；（6）EVs-细胞相互作用验证：使用尼罗红标记EVs进行荧光显微镜观察，以及将阿霉素包封入EVs后通过共聚焦显微镜验证药物递送。菌株来源方面，WUT216和WUT240分离自乳制品，B0399来源于意大利商业益生菌补充剂DiarYeast。

四、讨论与结论

讨论部分指出，K. marxianus EVs的平均直径（约136.8–148.2 nm）略低于先前报道的YPD培养基中生长的K. marxianus EVs（157.7 nm），在酵母EVs常见的85–212 nm范围内属于中等尺寸。与酿酒酵母（Saccharomyces）菌株相比，K. marxianus表现出更高的EVs体积浓度，这可能与其更快的生长速率有关。蛋白质组分析揭示的核心蛋白组与Imparato等人报道的K. marxianus EVs蛋白质组仅有36种蛋白重叠，凸显了不同菌株间EVs货物组成的异质性；但功能层面两项研究一致表明EVs携带靶向关键代谢过程（包括碳水化合物代谢）的蛋白货物，且均含有参与细胞壁重塑和降解的酶（如Exg1）。本研究EVs货物中核糖体蛋白占比极高（约31%），提示这些囊泡可能调节靶细胞的基因表达或蛋白质合成。33种潜在生物标志物的筛选解决了该领域的一个关键方法学挑战，为在人细胞模型中追踪酵母EVs内化及其货物释放提供了无交叉反应风险的可靠工具。

在模拟消化液中的研究首次证明K. marxianus菌株能在模拟人体消化液的恶劣条件下分泌EVs。在模拟胃肠道条件下总EVs产量的下降并非由于分泌机制受损，而是由于酵母存活率降低和生物量积累减少所致；在SCF中孵育24 h后总产量恢复至对照水平，表明在足够长的孵育时间内生物量得以恢复。安全性评估方面，EVs在多种系统中均未表现出细胞毒性，包括不同组织来源的上皮模型和无脊椎动物模型G. mellonella，验证了K. marxianus EVs的生物学安全性。EVs在正常细胞中一致的抗氧化效应与其在癌细胞中高度菌株和细胞系依赖性的效应形成鲜明对比，其中在HCT 116细胞中观察到的促氧化响应值得进一步研究其机制。免疫原性方面，K. marxianus EVs在HT-29细胞中未诱导IL-8分泌，在G. mellonella血细胞中选择性升高IL-8样蛋白而不影响TNF-α样蛋白水平，与LPS引发的广泛促炎级联反应形成对比，表明其具有选择性免疫调节作用而非非特异性促炎效应。最后，尼罗红标记EVs的快速细胞相互作用以及DOX成功递送至细胞核的功能性证据，共同证实了K. marxianus EVs作为药物递送系统的可行性。

研究结论部分指出：本研究证明了K. marxianus B0399、WUT240和WUT216菌株释放EVs的能力，在SAB培养基中生产效率约为10¹⁰ EVs/mL。此外，K. marxianus也能在模拟人胃肠道环境（胃、小肠和大肠）中产生EVs，但生产率略低于SAB培养基。重要的是，酵母囊泡对正常人肠道细胞系无毒性，既不负面影响代谢活性也不升高ROS水平，甚至表现出温和的抗氧化特性。免疫原性研究强调了其安全性，在HT-29细胞系的后期反应中未诱导促炎趋化因子IL-8的产生。此外，K. marxianus EVs能够在体外与人上皮细胞相互作用并将生物活性分子（如阿霉素）递送至细胞内。当然，还需要在更高级的模式生物中进一步研究其效应，包括其自身货物（蛋白质、DNA和RNA）的递送及免疫原性。