《International Journal of Molecular Sciences》：ROCK Inhibition Suppresses Thrombospondin-1 and Rewires DNA Methylation in the Trabecular Meshwork
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Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂降低小梁网（TM）细胞中的细胞骨架张力，但这一急性反应与持续细胞外基质重塑之间的联系机制仍未完全阐明。本研究探讨了ROCK抑制剂Y39983是否在原发性人小梁网（hTM）细胞中调控血小板反应蛋白-1（THBS1）及DNA甲基
Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂降低小梁网（TM）细胞中的细胞骨架张力，但这一急性反应与持续细胞外基质重塑之间的联系机制仍未完全阐明。本研究探讨了ROCK抑制剂Y39983是否在原发性人小梁网（hTM）细胞中调控血小板反应蛋白-1（THBS1）及DNA甲基化程序——已知二者可调节细胞外基质（ECM）重塑。研究人员将原代hTM细胞分别用Y39983、5-氮杂胞苷（5-Aza，一种DNA甲基转移酶抑制剂）或两者联合处理。通过RT-qPCR评估THBS1、DNA甲基转移酶、ECM及细胞骨架分子的基因表达；通过甲基化特异性PCR检测THBS1启动子甲基化状态；利用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）描绘全基因组甲基化重塑图谱并进行通路富集分析。5-氮杂胞苷消除了Y39983对DNMT1和DNMT3A的效应，并减弱了THBS1的调控。甲基化特异性PCR提示Y39983处理后THBS1启动子甲基化发生改变；WGBS鉴定出8845个差异甲基化基因，包括5608个低甲基化和3237个高甲基化基因，富集于ErbB信号通路、粘着斑及肌动蛋白细胞骨架调控。此外，Y39983降低THBS1的基础表达及刺激诱导表达，并下调包括COL4A1、COL6A1和ACTG1在内的ECM及细胞骨架相关基因。上述发现表明，ROCK抑制与hTM细胞中DNMT相关基因表达和DNA甲基化模式的改变相关。然而，由于5-氮杂胞苷的作用不限于选择性抑制DNMT，仍需采用正交方法开展进一步研究，以确定DNA甲基化是否直接介导Y-39983的转录反应。
**ROCK抑制重塑小梁网细胞外基质：THBS1与DNA甲基化的潜在关联**
**1. 研究背景与科学问题**
青光眼是全球首位不可逆致盲眼病，以进行性视神经病变为特征，与眼内压（IOP）升高密切相关。IOP的主要决定因素是房水经常规流出通路的流出阻力，该通路包括小梁网（TM）、邻管组织（JCT）和Schlemm管。青光眼中流出阻力增加与TM内异常细胞骨架张力、细胞-基质粘附改变以及细胞外基质（ECM）过度沉积密切相关。Rho相关蛋白激酶（ROCK）是肌动蛋白细胞骨架的核心调控因子，通过控制肌球蛋白轻链磷酸化、应力纤维形成和粘着斑成熟，调节TM细胞的收缩性。ROCK抑制剂可降低TM细胞骨架张力、促进细胞松弛并有效降低IOP，但其急性细胞松弛反应如何与长期ECM重塑相联系，分子机制仍不完全清楚。血小板反应蛋白-1（THBS1）是一种基质细胞蛋白，可激活潜伏型转化生长因子-β（TGFβ），在TM纤维化中发挥关键作用。DNA甲基化由DNA甲基转移酶（DNMTs）介导，可将细胞外信号转化为稳定的基因表达变化。既往研究表明，糖皮质激素可改变TM细胞中THBS1启动子甲基化及DNMT表达，ROCK抑制可下调THBS1，提示THBS1可能是连接机械转导与表观遗传调控的重要枢纽。
**2. 研究内容与结论概述**
研究人员提出假说：Y39983处理可能与甲基化相关过程及转录变化有关。利用原代hTM细胞，研究人员采用Y39983、5-氮杂胞苷（5-Aza）、地塞米松（DEX）、TGFβ1以及THBS1过表达等多种处理方案，结合RT-qPCR、甲基化特异性PCR（MSP）和全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）等互补技术，系统评估了ROCK抑制相关的转录和甲基化变化。研究发现Y39983可下调THBS1及ECM/细胞骨架相关基因，并伴随全基因组DNA甲基化模式的广泛改变，富集于ErbB信号和粘着斑等通路。研究提示ROCK抑制可能通过表观遗传重塑参与TM生理的长期调节，但尚未确立直接的因果机制。
**3. 关键研究方法**
研究使用3株独立供体的原代hTM细胞。处理方法包括：Y39983（1 μM）处理48小时；5-Aza（0.5或1 μM）处理2天；DEX（300 nM）处理7天且Y39983在最后2天加入；TGFβ1（10 ng/mL）处理3天且Y39983在最后2天加入；THBS1过表达质粒转染24小时后加Y39983处理48小时。基因表达采用RT-qPCR检测；THBS1启动子甲基化状态通过MSP评估；全基因组甲基化谱经WGBS测定，以β值反映甲基化水平，以Δβ绝对值≥0.1且名义p<0.05定义差异甲基化基因（DMGs），并通过ShinyGO进行GO和KEGG通路富集分析。
**4. 研究结果**
**4.1 5-氮杂胞苷改变Y39983相关的DNMT1、DNMT3A和THBS1转录水平变化**
Y39983处理升高DNMT1和DNMT3A基因表达并下调THBS1；与5-Aza联合处理可完全阻断Y39983诱导的DNMT1和DNMT3A升高，并减弱THBS1的调控。单独5-Aza可增加THBS1表达。结果提示DNMT相关过程可能参与Y39983的转录效应。
**4.2 MSP提示Y39983处理后THBS1启动子甲基化模式改变**
MSP分析显示，对照培养物中同时存在甲基化和非甲基化PCR产物。在3个供体株系中，对照组的非甲基化THBS1信号强于Y39983处理组，而甲基化信号无一致差异。该结果提示Y39983处理后引物定义区域内THBS1启动子非甲基化信号发生改变，但由于MSP为半定量方法，且甲基化信号差异不稳定，该发现需通过定量位点特异性甲基化分析加以确认。
**4.3 探索性WGBS分析鉴定出与ErbB和粘着斑通路相关的候选甲基化变化**
WGBS共鉴定出8845个DMGs，包括5608个低甲基化和3237个高甲基化基因。KEGG富集分析显示ErbB信号通路和EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路显著富集；Pathview可视化进一步显示DMGs广泛分布于粘着斑通路（包括ECM-整合素信号、粘着斑激酶信号、肌动蛋白细胞骨架调控及PI3K-Akt/MAPK相关组分）和ErbB信号通路（包括ErbB受体模块及下游RAS-RAF-MEK-ERK、PI3K-AKT-mTOR、Src/FAK和STAT相关信号轴）。THBS1未出现在供应商提供的候选DMG列表中，也无THBS1相关区域满足DMR报告标准，说明WGBS未独立支持THBS1位点的甲基化差异。
**4.4 ROCK抑制抑制WGBS中鉴定的纤维化和细胞骨架基因的基础及刺激诱导性上调**
研究人员选取COL4A1、COL6A1、ACTG1和THBS1进行表达分析。单独Y39983将THBS1、COL4A1和COL6A1基础表达降至对照的约0.5–0.7倍，ACTG1降至约0.7倍。DEX使THBS1升高至约1.8–2.0倍，COL4A1和COL6A1升高约1.4–1.6倍，ACTG1升高约1.2倍；加入Y39983可减弱上述诱导。THBS1过表达使THBS1升高约1.7–1.9倍、COL4A1/COL6A1升高约1.4–1.6倍，Y39983可抑制该升高。TGFβ1使THBS1、COL4A1和COL6A1升高至约1.5–1.9倍，联合Y39983后降至约1.1–1.2倍。结果表明Y39983能够抑制基础及DEX、THBS1过表达和TGFβ1诱导的ECM和细胞骨架基因表达。
**5. 讨论与结论**
本研究表明，ROCK抑制剂Y39983在hTM细胞中抑制THBS1及ECM/细胞骨架相关基因表达，并与DNMT表达改变、THBS1启动子甲基化及全基因组DNA甲基化模式变化相关联。THBS1作为潜伏TGFβ的激活剂，其下调为ROCK抑制剂减弱ECM沉积和改善组织僵硬提供了可能机制。Y39983同时能有效抑制DEX和TGFβ诱导的ECM基因上调，提示其在类固醇性青光眼和开角型青光眼中具有潜在抗纤维化价值。然而，5-氮杂胞苷具有非选择性效应，且研究未直接操控DNMT或特定甲基化位点，因此尚不能确立DNA甲基化直接介导Y39983转录反应的因果关系。WGBS结果由于未进行多重检验校正，属于假说生成性质。未来需采用定量位点特异性甲基化分析、DNMT特异性敲低或药理学抑制，以及治疗撤药后的纵向研究，来进一步验证这些发现的持久性和功能意义。总体而言，ROCK抑制剂可能不仅作为细胞骨架松弛剂，更作为TM生物学整合调节剂，为青光眼的多因素治疗提供新思路。
