部分甲基化结构域（PMDs）内多样性转录调控与表观遗传重编程通过调控上皮–间质转化（EMT）和免疫抑制促进食管鳞状细胞癌（ESCC）进展

《Epigenetics》：Diverse patterns of transcriptional regulation and epigenetic reprogramming within PMDs contribute to ESCC progression by regulating EMT and immunosuppression

部分甲基化结构域（partially methylated domains，PMDs）代表广泛的全基因组低甲基化区域，可驱动基因组不稳定和原癌基因激活。然而，其对肿瘤特异性转录网络的复杂调控影响仍大多不明。在本研究中，研究人员开发了一个稳健的计算流程，用于表征泛癌中异常PMD景观。研究人员特别关注与食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）转录失调相关的表观遗传特征。通过分析基因表达模式，研究人员将PMDs分为四个不同类别，并揭示若干免疫抑制基因在多种癌症的Tumor-PMDs内反复激活。尽管这些PMDs通常以抑制性H3K27me₃升高和活跃组蛋白修饰减少为标志，但其内激活基因却看似矛盾地在转录起始位点（transcription start sites，TSSs）附近表现出H3K9ac和H3K27ac的精确局部富集。这种局部表观遗传重编程提示一种潜在关联，即协同组蛋白修饰景观可能塑造致癌染色质重塑，从而许可转录失调。此外，研究人员鉴定出预后基因ATP6V₀D2与已知免疫检查点（HAVCR2、TDO2）之间存在稳健共表达轴。ATP6V₀D2表达升高可能通过激活补体系统和上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）通路促进ESCC进展和不良预后。基于这些发现，虚拟筛选和体外验证提示咖啡酸（caffeic acid）可作为潜在ATP6V₀D2结合化合物，有效抑制ESCC细胞迁移和活力。本研究进一步提名咖啡酸作为ESCC中进一步机制和治疗研究候选化合物。

表观遗传失调是癌症起始和进展的基本调控机制。DNA甲基化异常包括全基因组低甲基化和局部高甲基化。既往研究多关注CpG岛，其在健康组织低甲基化、癌症中异常高甲基化，导致抑癌基因转录沉默。但CpG岛仅约占全基因组CpG位点的6%，限制全面阐明异常甲基化的功能。PMDs是全基因组最广泛的DNA低甲基化区域，见于胎盘和肿瘤组织，在癌变早期出现并随疾病进展扩展，约占癌症基因组50%，与抑制性染色质和转录沉默B compartment重叠，基因密度和GC含量低，与基因组不稳定相关。近期前列腺癌研究发现PMDs可能通过抑制抗原呈递相关基因触发免疫逃逸。但若干问题待解：PMDs含多个基因，既往常仅关注其内第一个基因，不同基因是否共享调控模式不明；PMDs含多种组蛋白修饰信号但不覆盖整个区域，异常DNA甲基化与组蛋白修饰协同调控不清；PMDs功能是否跨癌一致及PMDs与基因转录关系不明。因此，研究人员建立计算框架识别ESCC异常PMDs，整合多组学，在窄基因组尺度寻找激活免疫抑制基因集的调控因素，并鉴定ATP6V₀D2及候选化合物咖啡酸。

研究人员利用全基因组甲基化数据和转录组等多组学，识别ESCC中650个Tumor-PMDs，覆盖29.94%基因组区域，含4067个基因。通过表达模式分类发现Tumor-PMDs内基因呈多样、上调、下调和稳定四种模式，其中多样模式比例最高，泛癌亦常见。泛癌共享的多样PMDs富集免疫调控基因。Tumor-PMDs整体富集抑制性H3K27me₃且缺乏活跃修饰，但上调基因TSS附近富集H3K9ac、H3K27ac等活跃信号；边界富集活跃修饰和开放染色质，调控细胞周期相关基因。功能注释提示Tumor-PMDs内上调基因参与免疫、炎症、细胞外基质和细胞周期，下调基因参与髓系和肥大细胞活化及代谢黏附。研究人员通过EPIC和WGCNA筛选与巨噬细胞浸润相关的共表达基因，鉴定出ATP6V₀D2等8个候选基因。ATP6V₀D2高表达与ESCC不良预后相关，并富集EMT和补体通路。虚拟筛选和体外实验提示咖啡酸可与ATP6V₀D2结合并抑制ESCC细胞迁移和活力。该研究揭示PMDs内表观遗传重编程可能使致癌和免疫抑制程序绕过广泛抑制环境，提名ATP6V₀D2为预后和治疗候选靶点，咖啡酸为候选化合物。

关键技术方法：样本队列来源包括GSE149612的10例ESCC和9例癌旁组织WGBS/RNA-seq，UCSC Xena中TCGA的BLCA n=6、BRCA n=5、LUAD n=5、LUSC n=4、STAD n=4、UCEC n=5的WGBS，GEO ChIP-Seq GSE155183、GSE131490、GSE142861、GSE151838，AZA相关GSE57130，TCGA食管癌染色质可及性33套，单细胞GSE209524。方法包括100 kb分箱、PCA、MethPipe识别PMD，bedtools subtract鉴定Tumor-PMDs/Normal-PMDs/Share-PMDs，DESeq2差异表达并四分类；整合ChIP-seq和ATAC分析组蛋白修饰与染色质可及性；EPIC估计免疫浸润、WGCNA筛选共表达模块；Cox回归、log-rank检验和GSEA；Enrichr药物预测、AutoDock/Vina分子对接、CETSA、CCK-8、伤口愈合、流式凋亡和细胞周期及Western blot验证。

研究结果：
1. Tumor-PMDs内基因具有多样性转录调控模式。研究人员用ESCC WGBS识别650个Tumor-PMDs，覆盖29.94%基因组区域，含4067个基因。DESeq2发现6014个差异表达基因，其中264个上调、499个下调位于Tumor-PMDs。四类中diverse-PMDs占65.3%，stable-PMDs占29.34%，down-PMDs占3.47%，up-PMDs占1.89%，说明同一Tumor-PMDs内转录失调与稳定基因共存。宽度分布相似，up/down PMDs多位于基因贫乏区，diverse/stable PMDs位于基因丰富区，diverse可含多达111个基因。GPR12位于down-PMDs且表达降低，CXCL13位于up-PMDs且表达升高，ST8SIA6-AS1位于diverse-PMDs且异常上调。

2. 泛癌共享的diverse-PMDs富集免疫调控基因。在TCGA六种癌症中，diverse-PMDs比例最高，分别为BLCA 48%、BRCA 42%、LUAD 55%、LUSC 44%、STAD 74%、UCEC 45%。418个diverse-PMDs在至少50%癌症共享，718个基因共享。共享基因功能富集抗原加工与呈递以及淋巴与非淋巴细胞间免疫调节，并富集KIR基因家族和CD1基因家族等免疫相关基因。

3. Tumor-PMDs内基因表达伴随多种表观遗传修饰。对763个差异表达基因和1780个启动子差异甲基化CpG分析，约13%基因启动子甲基化与表达显著负相关。67个基因启动子低甲基化且高表达，33个高甲基化且低表达，113个正相关，其他异常模式可能与EZH2和CTCF有关。EZH2信号在Tumor-PMDs内高于外。上调基因TSS附近富集H3K4me₃、H3K9ac、H3K27ac和BRD4，下调基因富集H3K27me₃，ATAC信号无显著差异。SNAI2位于Tumor-PMDs，活跃组蛋白信号强而H3K27me₃有限，ESCC中显著上调，单细胞分析提示富集于上皮细胞和成纤维细胞。

4. Tumor-PMD边界富集活跃组蛋白修饰并调控细胞周期相关基因表达。Tumor-PMDs内抑制性修饰富集、活跃修饰缺乏；边界富集H3K27ac、H3K9ac、H3K4me₃，染色质可及性增加。边界5 kb区域与启动子交集含357个基因，参与染色体组织负调控、蛋白质定位、甲基化和I型干扰素信号等。BUB1启动子位于边界，活跃修饰富集、DNA甲基化低、H3K27me₃低。357个基因中18个为转录因子，其中10个属zf-C2H2家族。

5. 预后风险基因ATP6V₀D2可能通过补体和EMT通路参与ESCC进展。功能注释显示下调基因主要与髓系细胞和肥大细胞活化、脂肪酸代谢和细胞黏附相关，上调基因参与适应免疫、炎症、细胞周期中/后期转变负调控、胶原形成和细胞外基质组织。COL1A2、SIGLEC7、HAVCR2和TIGIT在ESCC中显著上调，COL1A2和TIGIT启动子甲基化与表达负相关。EPIC和WGCNA发现红色模块与巨噬细胞浸润显著相关，并交叉GSE149612、TCGA和红色模块得到8个基因。ATP6V₀D2高表达是生存风险因素，生存期短，表达上调且启动子甲基化降低，AZA处理上调其表达。ATP6V₀D2表达与巨噬细胞和癌相关成纤维细胞浸润正相关，与CD8⁺ T细胞负相关。GSEA显示高表达组EMT和补体通路富集，CDKN2A、CDKN1C、IL1A和IL1B下调。

6. 虚拟筛选鉴定咖啡酸为潜在ATP6V₀D2结合化合物并抑制ESCC细胞增殖和迁移。Enrichr筛选候选药物，分子对接显示咖啡酸与ATP6V₀D2结合最强。CETSA显示咖啡酸改变ATP6V₀D2热稳定性。咖啡酸抑制KYSE-30和KYSE-510迁移和细胞活力。KYSE-30中咖啡酸下调ATP6V₀D2和N-cadherin、上调E-cadherin并增加凋亡；KYSE-510中未观察到ATP6V₀D2、EMT和凋亡的类似变化，但诱导S期阻滞，G₀/G₁减少、S增加，Cyclin D1下调。提示细胞系特异性反应。

讨论指出，异常DNA甲基化普遍，既往将全基因组低甲基化与基因组不稳定和原癌基因激活关联，但基因与异常甲基化区域位置错位，PMDs内转录特征不清。本研究设计计算框架，在ESCC WGBS中识别650个共同异常Tumor-PMDs，发现一致表达模式普遍，符合PMD低转录活性；但diverse表达模式比例最大，差异表达和稳定基因散布，提示PMD外因素协同调控。该模式并非ESCC特有，泛癌一致。PMDs富集H3K27me₃且缺乏活跃修饰，但活跃基因TSS附近可检测H3K9ac和H3K27ac，局部信号可能与PMD协同激活小尺度基因组区域。边界富集zf-C2H2转录因子，其生物学意义需进一步探索。PMD内转录激活基因与细胞外基质组织和免疫调节相关；WGCNA识别8个与巨噬细胞浸润相关共表达基因。ATP6V₀D2高表达与ESCC不良预后相关，启动子DNA甲基化降低可能是其表达升高因素；高表达富集EMT和补体。ATP6V₀D2可能作为癌基因通过免疫逃逸和EMT促进ESCC。虚拟筛选发现咖啡酸，CETSA提示其改变ATP6V₀D2热稳定性，KYSE-30中降低ATP6V₀D2蛋白；但尚未建立直接或间接作用，其他Tumor-PMD基因是否受影响需系统研究。咖啡酸抑制ESCC细胞迁移和活力。KYSE-30中下调ATP6V₀D2、逆转EMT并诱导凋亡；KYSE-510中不影响ATP6V₀D2、EMT或凋亡，但诱导S期阻滞，G₀/G₁减少、S增加、Cyclin D1降低。细胞系差异可能反映肿瘤异质性和治疗压力下信号通路依赖重塑。未来需ESCC异种移植或荷瘤小鼠模型评估咖啡酸疗效和转化潜力。结论翻译：总之，研究人员通过整合计算框架系统表征了ESCC中部分甲基化结构域（PMDs）内异常转录景观。在Tumor-PMDs内，局灶性活跃组蛋白标记与基因激活共存。这提示一种潜在表观遗传重编程模式，可能使致癌和免疫抑制程序绕过更广泛的抑制性PMD环境。通过多组学解剖，研究人员确定ATP6V₀D2是与EMT和补体通路激活相关的关键预后候选基因。此外，虚拟筛选和体外验证表明，咖啡酸可能作为潜在ATP6V₀D2结合化合物。这些发现为进一步研究咖啡酸和ATP6V₀D2相关调控机制在ESCC中的作用提供了依据。