正常精子症内部的分子异质性：一项基于混合池的小RNA测序初步研究

《Biomolecules》：Molecular Heterogeneity Within Normozoospermia: A Pilot Pooled Small RNA Sequencing Study

专业术语翻译（摘要部分） 正常精子症（Normozoospermia）是指精液参数高于世界卫生组织（WHO）下限参考值的一种状态，传统上被视为单一类别。越来越多的证据表明，这一分类可能涵盖分子异质性。本项初步混合池测序研究（pilot-pooled sequencing study）旨在探讨在正常精子症范围内具有不同表型的男性是否表现出不同的精子miRNA谱。研究纳入了30名正常精子症男性，根据精子浓度和正常形态率将其分为三个由研究人员定义的组别：中等浓度/形态组（NORMAV）、高浓度组（>80 × 106/mL；NORMCOUNT）和高形态率组（>9%正常形态；NORMMOR）。研究人员对每组两个生物学重复混合池进行了精子小RNA测序（small RNA sequencing），随后进行了差异表达分析（q值 < 0.01，|log2FC| > 1）以及仅限于强验证miRNA–靶基因相互作用的功能分析。在所有两两比较中均检测到混合池水平的miRNA丰度差异，其中miR-34c-3p、miR-891b、miR-145-5p和miR-1-3p为反复失调的miRNA。基于数据库整理的miRNA靶基因功能富集分析提示这些差异集中于增殖、凋亡、发育和细胞内信号转导，包括PI3K–Akt、MAPK和FoxO信号通路。所有比较中共有568个共享基因，其中VEGFA、IGF1R和PTEN是最为反复出现的靶基因。这些探索性研究结果表明，在所调查的正常精子症各组之间，精子miRNA在混合池水平上存在差异，并确定了可供后续个体水平验证的候选miRNA。未来需要采用个体样本测序和正交验证的大规模研究来确定这些差异是否在参与者中一致存在。

论文解读

一、研究背景与问题

不孕症是全球重大的生殖健康问题，世界卫生组织（WHO）估计1990—2021年成人终生患病率约为17.5%，期间患病率约为12.6%。男性因素独立或联合女性因素约占所有不孕症病例的近一半。传统精液分析仍是男性生育力评估的基石，但以WHO参考下限为界将精液特征划分为正常或异常的二分类方法，可能掩盖了同一诊断类别内男性之间具有生物学意义的变化。正常精子症并不必然代表生物学上均质的状况——在满足WHO参考标准的男性中，精子浓度、总数、前向运动力、形态、活力和总活动精子数均可能存在显著差异。越来越多的证据表明，即使在正常精子症男性中也存在分子异质性：Salas-Huetos等人（2016）证明正常精子症的可育与不育男性表现出不同的精子miRNA表达谱；Denomme等人（2017）报道了正常精子症男性中与囊胚发育不良相关的精子DNA甲基化和miRNA谱改变；Santiago等人（2023）发现父亲年龄与正常精子症男性精子miRNA谱差异相关。然而，专门研究正常精子症范围内不同精液表型之间分子变异的研究仍然有限。本研究正是针对这一空白，旨在通过表征由精子浓度和正常形态定义的研究者设定正常精子症表型组间的精子miRNA表达谱，探讨正常精子症内部的分子异质性。

二、研究内容与结论

研究人员开展了一项初步混合池测序研究，纳入30名年龄27—49岁的正常精子症男性，根据两次独立精液分析的结果将其分为三个互斥表型组（每组10人）：NORMAV组（精子浓度30—75 × 10⁶/mL且正常形态≥4%但<9%）、NORMCOUNT组（精子浓度>80 × 10⁶/mL且正常形态<9%）和NORMMOR组（正常形态>9%且精子浓度<80 × 10⁶/mL）。所有参与者均满足WHO第6版正常精子症参考标准。研究人员在每组内将10名参与者分为两个各含5人的独立生物学重复混合池，共6个RNA混合池，进行小RNA测序和差异表达分析。研究鉴定出各组间存在混合池水平的miRNA丰度差异，并确定了多个候选miRNA和相关的调控通路，提示正常精子症内部可能存在分子变异。该研究的重要意义在于首次在正常精子症范围内基于精子浓度和形态的研究者设定分层之间进行特异性比较，为后续个体水平验证提供了候选分子靶标。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：小RNA测序（small RNA sequencing）在Illumina NovaSeq平台进行单端50 bp测序，每文库约2000万原始读段；生物信息学分析使用Trimmomatic v0.36进行质量控制，Bowtie 2比对至人类参考基因组（GRCh38/hg38），miRBase v20.0鉴定已知miRNA，sRNAtoolbox 2.0进行miRNA注释，miREvo v1.1和mirDeep2 v2.0.1.2预测新miRNA；差异表达分析使用DESeq2版本1.50.2，以Storey q值进行多重检验校正；靶基因检索使用miRTargetLink 2.0，仅纳入强验证的miRNA–靶基因相互作用；功能富集分析使用ShinyGO v0.85进行基因本体论（GO）和KEGG通路分析。样本队列来源为希腊色萨利大学（University of Thessaly，Volos, Greece）伦理委员会批准的临床队列。

四、研究结果

4.1 参与者与精液特征

三组之间在精子浓度（p < 0.001）和正常形态（p < 0.001）方面存在显著差异，总精子数也存在显著差异（p < 0.001），这与NORMCOUNT组显著较高的精子浓度一致。年龄、禁欲时间、BMI、精液量、前向运动力、总运动力、活力、吸烟和饮酒状态在三组间无显著差异，表明各组除与预设分层直接相关的精液特征外基本可比。

4.2 小RNA测序数据质量与miRNA鉴定

6个文库各产生2043万—2148万原始读段，质控后保留1949万—2089万干净读段（保留率95.39%—98.19%）。比对至人类参考基因组的比例为73.35%—80.50%。已知成熟miRNA鉴定数为465—537个，NORMCOUNT文库检出数量最高。每个文库还鉴定出12—15个候选新miRNA。组内两个生物学重复的R²值较高（NORMAV为0.945，NORMCOUNT为0.965，NORMMOR为0.959），而组间R²值为0.784—0.910。

4.3 差异miRNA表达

NORMCOUNT与NORMAV比较鉴定出213个显著差异表达（DE）miRNA（106个上调、107个下调），上调最强者为hsa-miR-891b、hsa-miR-34c-3p和novel_46，下调最强者为hsa-miR-142-3p、novel_75和hsa-miR-145-5p。NORMAV与NORMMOR比较鉴定出192个DE miRNA（104个上调、88个下调），上调最强者为hsa-miR-1-3p、novel_75和hsa-miR-889-3p，下调最强者为hsa-miR-891b、hsa-miR-34c-3p和hsa-miR-664a-3p。NORMCOUNT与NORMMOR比较鉴定出103个DE miRNA（40个上调、63个下调），上调最强者为hsa-miR-1-3p、hsa-miR-106a-3p和hsa-miR-708-3p，下调最强者为hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23b-5p和hsa-miR-411-5p。三个比较中共有19个miRNA均满足差异表达标准。

4.4 靶基因鉴定与功能富集分析

NORMCOUNT与NORMAV比较鉴定出1342个重叠靶基因，GO富集涉及管状形态发生、发育和循环系统发育、转录和RNA生物合成调控、细胞增殖分化、凋亡等生物学过程，KEGG富集涉及FoxO、MAPK和PI3K-Akt信号通路、黏着斑和细胞衰老。NORMAV与NORMMOR比较鉴定出1254个靶基因，富集于发育调控和形态发生、细胞增殖和程序性细胞死亡、细胞内信号转导等过程，KEGG涉及PI3K–Akt、MAPK、FoxO和TNF信号通路。NORMCOUNT与NORMMOR比较鉴定出898个靶基因，富集于细胞增殖和死亡调控、发育和分化相关过程，KEGG涉及PI3K–Akt和MAPK信号通路、黏着斑和细胞衰老。568个靶基因在三个比较中共享，VEGFA是最反复出现的靶基因（分别被21、21和11个DE miRNA靶向），其他反复靶基因包括IGF1R、BCL2、PTEN、CDK6、MYC、MET和CCND1。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，本研究发现正常精子症男性中基于浓度和形态的研究者设定组间存在混合池水平的精子miRNA丰度差异，提示miRNA相关的分子变异可能不仅限于正常与病理精液谱之间的比较，也可在传统正常范围内的浓度和形态分层中检测到。miR-34c-3p和miR-891b在NORMCOUNT和NORMMOR中均高于NORMAV，呈一致方向；miR-145-5p在NORMCOUNT中低于NORMAV和NORMMOR；miR-1-3p在NORMAV和NORMCOUNT中高于NORMMOR。功能富集反复涉及PI3K–Akt、MAPK和FoxO信号通路，这些通路在精原干细胞自我更新与分化、减数分裂进程、精子细胞分化及支持细胞增殖中具有已知作用。VEGFA作为最反复靶基因，其在小鼠中的实验性破坏与生育力下降和精子数量减少相关；IGF1R与支持细胞增殖和成人睾丸大小及每日精子产量相关；PTEN作为PI3K/AKT的负调控因子，对精原干细胞长期维持不可或缺。研究结论指出，这项初步混合池测序研究在代表正常精子症不同浓度和形态表型的混合池样本之间鉴定出精子miRNA丰度差异，突出了若干候选miRNA和相关调控通路，但这些发现是探索性和假设生成的，不应被解释为个体水平上已确立的分子标志。未来需要在更大规模的独立队列中进行个体样本测序和正交验证，以确定这些候选miRNA差异是否在个体间一致存在，并与精子功能指标和生殖结局相关联，从而评估其潜在的生物学和临床意义。