TPRX1与HERVL的顺序激活描绘人类8细胞样细胞诱导向全能样状态的进程

《Cell Reports》：Sequential TPRX1 and HERVL activation delineates a progression toward the totipotent-like state

　　

从人类多能干细胞（hPSCs）体外诱导8细胞样细胞（8CLCs），为研究全能性及合子基因组激活（ZGA）的调控原理提供了模型。然而，8CLC出现的细胞动力学仍知之甚少。在本研究中，研究人员生成了一种TPRX1-EGFP/HERVL-tdTomato双报告hPSC系，以解析全能样身份的逐步获得。他们发现8CLC诱导遵循有序轨迹，其中TPRX1激活先于TPRX1⁺HERVL⁺细胞的出现，后者在转录组上最接近体内8细胞胚胎。单细胞转录组学和时间分辨流式细胞术进一步定义了从primed状态经TPRX1⁺中间态向HERVL⁺ 8CLC状态的连续转变。CRISPRi和RNA定向干扰实验支持HERVL元件及HERVL来源RNA对这一转变的功能贡献，而潜在的位点依赖性机制仍未明确。总之，这些发现确立了TPRX1与HERVL的顺序激活作为人类8CLC诱导的一个定义性特征。

细胞可塑性——细胞在不同功能状态间转换的能力——是胚胎发育和干细胞培养的基础。在哺乳动物早期发育中，受精卵和早期卵裂球具有全能性，即产生所有胚内和胚外谱系的能力，但这种潜能随后逐渐受限。在naive人类胚胎干细胞（hESC）培养中，可自发出现表达8细胞（8C）胚胎标记的全能样细胞群，称为8细胞样细胞（8CLCs），提示多能性向全能性的转变是体外细胞可塑性的固有特征。已有研究通过转录因子过表达或化学重编程从primed人类多能干细胞（hPSCs）诱导8CLCs，这些细胞激活类似人类8细胞胚胎的转录程序，包括关键转录因子TPRX1、LEUTX，以及内源性逆转录病毒（ERV）HERVL家族（尤其长末端重复元件MLT2A1）的再激活。然而，8CLC出现的细胞动力学仍不清楚：现有诱导体系产生异质群体，各标记亚群间的时间与谱系关系不明；TPRX1和HERVL是同时激活还是按顺序激活，以及单阳性/双阳性亚群是否代表连续轨迹上的不同中间状态，均未解决。

为解析全能样身份的逐步获得，研究人员建立了TPRX1-EGFP/HERVL-tdTomato双报告hPSC系，实时追踪两个标记的活性。通过结合单细胞转录组学和功能扰动，他们发现8CLC诱导遵循有序轨迹：TPRX1先激活，随后出现TPRX1⁺HERVL⁺双阳性终末细胞。该研究为理解人类体外全能样状态的形成提供了路线图。

关键技术方法上，研究人员利用CRISPR技术将EGFP敲入内源TPRX1位点，并整合由HERVL长末端重复序列驱动的tdTomato报告基因，构建双报告hPSC系（H9背景）；通过优化的me4CL化学诱导方案从primed hPSCs诱导8CLCs。研究使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、时间分辨流式细胞术、荧光激活细胞分选（FACS）和活细胞成像追踪亚群动态；以CRISPR干扰（CRISPRi）沉默MLT2A1，结合反义寡核苷酸（ASO）和RNA过表达解析HERVL RNA功能；并用ATAC-seq、CUT&Tag和RNA-seq进行分子表征。样本队列包括本研究的H9、CB0010和iPSC-3细胞系，以及已发表的人类胚胎scRNA-seq（Yan et al., 2013；Petropoulos et al., 2016）和ATAC-seq（Wu et al.）等公开数据。

**建立TPRX1/HERVL双报告系统监测8CLC诱导**：研究人员利用CRISPR技术将EGFP敲入TPRX1基因座，并整合HERVL-LTR驱动的tdTomato报告基因，构建了双报告H9细胞系。他们优化了me4CL化学诱导方案，在诱导第3天（me4CL-D3）检测到三个亚群：TPRX1⁺HERVL⁺（9.07%）、TPRX1⁺单阳性（19.30%）和HERVL⁺单阳性（1.73%）。RT-qPCR证实8CLC相关基因（如ZSCAN4、DPPA3、LEUTX等）和HERVL家族成员显著上调；免疫荧光确认双阳性细胞共表达8CLC标记并下调OCT4。通过对tdTomato阳性和阴性细胞进行RNA-seq，验证了报告基因对内源HERVL激活的忠实反映。

**单细胞转录组分析揭示异质性诱导轨迹和顺序TPRX1/HERVL表达**：对诱导时间序列进行scRNA-seq并与已发表人类胚胎数据整合，部分me4CL-D3细胞与8C/E3胚胎聚集。在me4CL-D3中鉴定出5个转录簇，其中簇4（8.51%）显示最强的8CLC基因和8C富集ERV激活，代表最成熟状态；簇2（15.1%）呈现中间过渡特征。按TPRX1和MLT2A1表达将细胞分层，双阳性细胞表达最高水平的核心8CLC基因。Monocle 2拟时分析显示TPRX1在早期被诱导，而MLT2A1在终末分支达峰；轨迹出现两个分支，状态1为完全诱导的8CLCs，状态5为未完全转变的中间态。

**TPRX1⁺HERVL⁺ 8CLCs源于TPRX1表达前体群体**：时间分辨流式细胞术显示TPRX1单阳性细胞在诱导第2天先出现，随后出现双阳性细胞，而HERVL单阳性细胞始终罕见。对FACS分选的亚群进行RNA-seq，主成分分析（PCA）显示TPRX1⁺HERVL⁺细胞最接近8C胚胎，TPRX1⁺HERVL^?细胞处于中间位置，双阴性细胞靠近primed态。活细胞成像显示约78%的新生双阳性细胞来自TPRX1⁺HERVL^?细胞，仅5.8%来自TPRX1^?HERVL⁺细胞。分选后培养实验证实，TPRX1⁺HERVL^?细胞的后代表达更高水平的8CLC基因。此外，已发表数据中TPRX1敲除会下调8CLC相关基因和ERV，但基序分析和CUT&Tag未发现TPRX1在HERVL位点显著结合，提示TPRX1可能间接调控HERVL。

**MLT2A1敲低损害向8CLC状态的进展**：利用CRISPRi靶向MLT2A1位点，研究人员实现了有效的转录抑制。MLT2A1敲低（KD）显著降低MLT2A1和8CLC相关基因表达，所有报告阳性群体比例下降，其中TPRX1⁺HERVL⁺双阳性分数下降最明显。RNA-seq显示8C特异基因被抑制，而替代发育程序基因上调；基因集富集分析（GSEA）证实8C特征减弱、内细胞团（ICM）/primed特征增强。ATAC-seq显示MLT2A1-KD导致约1,900个8C胚胎偏好开放峰丢失，约3,300个ICM富集峰获得，提示染色质景观从8C样转向ICM样。外源表达MLT2A1 RNA可部分恢复8CLC相关基因表达，ASO抑制HERVL RNA也降低这些基因，表明HERVL RNA有功能贡献，但基因座本身的作用尚未排除。

**人类胚胎扰动分析支持TPRX1-HERVL调控轴**：分析两个已发表的人类胚胎扰动数据集，发现TPRX1/TPRX2/TPRXL联合缺失可降低MLT2A1、MLT2A2等ZGA基因表达，而MLT2A1缺失在4C阶段影响TPRX1及其他ZGA基因。这表明早期胚胎中TPRX和HERVL相关通路存在功能联系，与8CLC系统观察到的一致。

讨论部分指出，双报告系统明确了TPRX1⁺HERVL⁺双阳性细胞比任一单标记更忠实于体内8C胚胎。HERVL活性对完成8CLC转变至关重要，其作用可能通过HERVL来源RNA实现，但不能排除DNA元件本身的顺式调控作用。TPRX1可能通过下游转录或染色质调节因子间接激活HERVL，而HERVL扰动也影响TPRX1，提示两者可能存在相互调控回路。这种顺序激活模式与小鼠2细胞样细胞中Zscan4-MERVL的顺序类似，可能代表一种保守的全能样状态获得机制；但TPRX1-HERVL轴可能只是汇聚于该程序的多条调控路径之一。

综上所述，本研究提供了多能性退出和向人类全能样状态推进的细胞事件路线图。通过建立能解析TPRX1和HERVL顺序激活的双报告平台，研究人员为解析8CLC身份的逐步获得提供了实用工具和概念框架。这些发现不仅阐明了8CLC诱导的谱系动态，也为探索人类早期细胞命运转变基本原理创造了机会。