红景天主要标志性成分同时测定的简化低溶剂消耗HPLC-UV/Vis方法

《Molecules》：A Simplified and Solvent-Reduced HPLC-UV/Vis Method for the Simultaneous Determination of Major Marker Compounds in Rhodiola rosea L.

　　

红景天（Rhodiola rosea L.）传统上用于缓解与压力相关的症状，并已被研究其在抑郁和焦虑方面的潜在作用。本研究开发并验证了一种减少溶剂消耗的HPLC-UV/Vis方法，用于测定红景天中特征性次生代谢产物。为尽量减少溶剂消耗并在样品前处理中不再使用甲醇，研究人员将40%（v/v）乙醇提取与简化的色谱方案相结合。采用HPLC-UV/Vis分析提取物中的目标分析物：红景天苷（salidroside）、酪醇（tyrosol）、rosarin、rosavin和rosin。使用水-乙腈梯度在0.8 mL min^?1流速下于35 min内完成色谱分离。与Ganzera等人报道的参比方法相比，优化后的方案将总分析时间从44 min缩短至35 min，并省去了运行后的甲醇冲洗步骤。方法验证得到分析物特异性回收率为102% ± 3%至114% ± 4%，相对标准偏差（RSD）为0.5%至8.0%。红景天苷、酪醇、rosarin、rosavin和rosin的定量限（LOQ）分别为0.497、0.302、0.477、0.148和0.189 μg mL^?1。采用外标校准进行定量。所开发的方法为定量测定红景天主要标志化合物提供了一种简化、减少溶剂消耗的方案，从而同时缩短了分析时间并减少了溶剂使用。

红景天（Rhodiola rosea L.）为景天科（Crassulaceae）多年生药用植物，天然分布于欧洲和亚洲的北极及亚北极地区，包括中国、蒙古、俄罗斯和斯堪的纳维亚等。其适应原样特性主要归因于特征性酚类次生代谢产物，根和根茎中含有高浓度的生物活性成分，与缓解压力、抗抑郁和免疫调节作用相关。欧洲药品管理局认可红景天根和根茎制剂为传统草药产品，用于暂时缓解疲劳和虚弱等压力相关症状。红景天中已鉴定出150多种生物活性化合物，其中红景天苷（salidroside）、酪醇（tyrosol）、rosarin、rosavin和rosin被视为重要的标志化合物，常用于评价植物材料和商业制剂的质量。然而，Ganzera等人建立的HPLC方法在样品制备和色谱冲洗中均依赖甲醇，且分析时间较长。为减少溶剂消耗、提高分析通量，研究人员以40%（v/v）乙醇提取替代甲醇提取，将流速降至0.8 mL min^?1，并省去含甲醇的后运行冲洗步骤，建立了一种简化的HPLC-UV/Vis方法，用于同时测定上述五种标志化合物。

研究人员采用该方法对红景天根和根茎提取物进行分析，并完成方法学验证。结果表明，优化方法在35 min内即可完成五种目标分析物的色谱分离，较原方法缩短约20%分析时间，同时未出现色谱性能的明显损失。在约两年、2200次色谱运行中，未观察到柱压明显升高或色谱柱异常磨损。方法验证显示，检测限（LOD）为0.049–0.164 μg mL^?1，定量限（LOQ）为0.148–0.497 μg mL^?1；相对标准偏差（RSD）为0.5%–8.0%，回收率为102% ± 3%至114% ± 4%。按每1000次分析计算，该改进方法可减少约16 L溶剂消耗（包括约2 L乙腈和14 L水）并节省约150 h分析时间，为红景天标志化合物的常规质量控制提供了实用、低溶剂消耗且资源高效的分析手段。

关键技术方法方面，研究人员采用40%（v/v）乙醇进行超声辅助提取，重复提取三次，离心、过滤后进样。色谱分离采用ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱（150 × 4.6 mm，5 μm）及同型保护柱，流动相为水-乙腈梯度，流速0.8 mL min^?1，柱温30 °C，检测波长205 nm。采用外标法定量，并分别评价线性、精密度、准确度、LOD和LOQ。植物材料来自德国图林根一处栽培田，为第四年收获的红景天根和根茎。

研究结果部分如下。

2.1 HPLC-UV/Vis分析

2.1.1 次生代谢产物
研究人员考察了红景天苷、酪醇、rosarin、rosavin和rosin五种标志化合物。UV/Vis光谱显示，rosarin、rosavin和rosin在约205 nm处有最大吸收，而红景天苷和酪醇在约225 nm处有最大吸收。尽管205 nm并非后两者的最大吸收波长，其信号强度仍足以可靠检测和定量。因此，研究人员选择205 nm作为折中检测波长，可在单次色谱运行中同时检测全部五种目标分析物，有利于常规定量分析。

2.1.2 方法细节
研究人员在Ganzera等人方法基础上，将流速降至0.8 mL min^?1，省略以0.1%磷酸甲醇溶液进行的后运行冲洗步骤。乙腈比例从10%升至20%，总运行时间35 min。在两年约2200次运行中，未观察到柱压明显升高、色谱性能下降或保护柱/分析柱异常磨损。五种目标分析物的保留时间分别为5.523、8.217、22.680、23.610和25.507 min。外标校准曲线显示各分析物在考察浓度范围内线性关系良好；与原始方法相比，改进方法在降低方法复杂性的同时保持了足够的信号强度。

2.2 方法验证

2.2.1 峰分离度
研究人员使用分离度因子（R_s）评价色谱分离性能。与原始方法相比，rosarin和rosavin的分离度相近，而rosavin和rosin之间的分离度从1.10 ± 0.10提高至2.30 ± 0.06，分析时间从44 min缩短至35 min。然而，rosarin和rosavin未实现完全基线分离，这与二者结构相似、糖基部分不同有关。

2.2.2 检测限与定量限
基于回归分析的标准差和校准曲线斜率计算LOD和LOQ。五种分析物的LOD范围为0.049–0.164 μg mL^?1，LOQ范围为0.148–0.497 μg mL^?1。rosavin的LOD和LOQ最低，红景天苷最高，表明各分析物在所选色谱条件下的灵敏度存在差异。所有分析物的LOQ均低于0.5 μg mL^?1，能够满足红景天提取物常规质量控制所需的灵敏度。

2.2.3 精密度与准确度
精密度通过重复分析同一红景天根和根茎提取物进行评价。红景天苷、酪醇、rosarin、rosavin和rosin的RSD分别为0.6%、8.0%、1.2%、0.5%和1.8%。除酪醇外，其余四种分析物的RSD均≤1.8%，表明方法重复性良好。准确度通过加标回收实验评价，回收率为102% ± 3%至114% ± 4%。酪醇、rosarin、rosavin和rosin的回收率接近100%，红景天苷则呈现正偏倚，在解释其定量结果时应予以考虑。

讨论与结论方面，研究人员综合评估了分离度、灵敏度、精密度和回收率数据，认为改进方法适用于红景天主要标志化合物的定量测定。研究表明，以40%乙醇替代甲醇、降低流速、省略后运行冲洗步骤，可在保持分析性能的同时显著减少溶剂消耗和分析时间。尽管rosarin–rosavin峰对未完全基线分离，但通过与认证参考标准的保留时间比对，目标分析物仍可可靠识别和重复定量。结论部分翻译如下：该HPLC-UV/Vis方法实现了红景天根和根茎提取物中红景天苷、酪醇、rosarin、rosavin和rosin的同时测定。以40%（v/v）乙醇替代甲醇进行样品制备、将流速降至0.8 mL min^?1并省略后运行甲醇冲洗步骤，使总运行时间从44 min缩短至35 min。按每1000次分析计算，这些改进减少了约16 L溶剂使用和约150 h总分析时间。所有五种分析物的LOD和LOQ分别低于0.17和0.50 μg mL^?1，RSD为0.5%–8.0%，回收率为102% ± 3%至114% ± 4%，其中红景天苷呈正偏倚。虽然rosarin–rosavin峰对未实现完全基线分离，但在研究条件下可通过与认证参考标准比较进行目标分析物的归属并实现可重复定量。总体而言，改进方法为红景天标志化合物的常规测定提供了一种简化且减少溶剂消耗的分析途径。