靶向清除肠道ROS通过微生物代谢物犬尿喹啉酸（KYNA）激活AhR通路介导Treg/Th17平衡缓解类风湿关节炎

《Gut Microbes》：Targeted intestinal ROS scavenging alleviated rheumatoid arthritis by microbial metabolite kynurenic acid mediated Treg/Th17 balance through AhR pathway activation

　　

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以免疫失调为特征的慢性自身免疫性疾病，常与肠道菌群（gut microbiota）稳态受损密切相关。过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）被认为是微生态免疫紊乱的关键驱动因素，直接促进炎症级联反应。然而，其潜在机制仍不清楚。在此，研究人员使用ROS清除剂，通过抑制肠道ROS并调节肠道微生物犬尿喹啉酸（kynurenic acid, KYNA）代谢来缓解RA进展。黑磷纳米片（black phosphorus nanosheets, BPNSs）作为有效的ROS清除剂，经口服给药清除肠道过量ROS，显著改善胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）小鼠的疾病严重程度。BPNSs选择性重塑肠道菌群并改变其代谢谱，提高色氨酸衍生代谢物KYNA的相对丰度。机制上，升高的KYNA激活幼稚CD4⁺ T细胞（na?ve CD4⁺ T cells）中的芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AhR）通路，通过抑制AKT/mTOR信号通路促进其向调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）分化。KYNA的治疗效果在CIA小鼠中进一步得到证实，其给药维持Treg/辅助性T细胞17（T helper 17 cells, Th17）平衡，减轻关节炎进展，并增强肠道屏障完整性。这些发现阐明了一种新的肠–免疫–骨轴（gut–immune–bone axis），其中清除肠道ROS驱动KYNA介导的AhR依赖性Treg细胞分化，从而提出一种有前景的基于ROS清除的RA治疗策略。

类风湿关节炎（RA）是一种慢性系统性自身免疫炎症性疾病，给全球健康系统和社会经济带来巨大负担。其发病涉及免疫失调、遗传易感和环境因素的复杂相互作用，尽管治疗已有进展，持续缓解和更有效策略仍是未满足的临床需求。大规模人群队列显示，肠道微生态失衡参与RA发生、进展和预后，但现有研究多集中于分类学特征或基因丰度，机制仍不完全清楚。RA与炎症性肠病（IBD）存在流行病学和生物学联系，IBD炎症肠组织中ROS升高和氧化应激明显；过量ROS破坏肠道菌群平衡并加重氧化应激，形成恶性循环。研究人员比较CIA小鼠与健康对照的肠道ROS，确认CIA小鼠存在显著肠道ROS积累，但程度低于IBD小鼠。据此，研究人员提出靶向清除肠道ROS可能也适用于RA治疗，并使用具有良好生物相容性和ROS清除特性的黑磷纳米片（BPNSs）开展研究。该研究证明，灌胃BPNSs清除肠道过量ROS具有RA治疗潜力；BPNSs重塑肠道微生态稳态，增加色氨酸代谢物犬尿喹啉酸（KYNA）产生；KYNA激活幼稚CD4⁺ T细胞中AhR依赖通路，促进其向Treg细胞分化。该研究发表于《Gut Microbes》，揭示了“肠道ROS清除–KYNA–Treg”轴，拓展了“肠–免疫–骨”轴的认识。

关键技术方法概述：研究使用8–10周龄雄性DBA/1J和C57BL/6小鼠，购自GemPharmatech (Nanjing, China)；DBA/1J用于CIA相关实验，C57BL/6用于其他动物实验；动物实验经陆军军医大学动物伦理委员会批准（AMUWEC20240069）。主要方法包括CIA模型构建、口服灌胃、抗生素鸡尾酒（ABX）耗竭菌群、粪菌移植（FMT）、微计算机断层扫描（micro-CT）、苏木精–伊红（H&E）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、免疫荧光、二氢乙锭（DHE）染色、宏基因组测序、粪便非靶向代谢组学、RNA测序、蛋白质印迹（Western blot）、实时定量PCR（qPCR）、流式细胞术、DSS诱导结肠炎、幼稚CD4⁺ T细胞分离与Treg分化、炎症因子阵列和分子对接。无人类样本队列。

研究结果：其一，BPNSs灌胃通过重塑全身免疫稳态失衡尤其是Treg/Th17失衡改善关节炎。谷胱甘肽（GSH）灌胃仅改善CIA小鼠爪肿胀，微CT骨组织形态计量和HE改善不显著；BPNSs灌胃显著改善爪肿胀，micro-CT显示骨结构保存，骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）升高，HE和TRAP染色支持关节保护。流式细胞术显示脾和肠系膜淋巴结（MLN）中CD4⁺ T细胞Treg比例增加、Th17减少，引流淋巴结（DLN）中Treg增加、Treg/Th17向调节表型偏移；CD8⁺ T细胞中IFN-γ⁺和TNF-α⁺无显著差异。脾和MLN中MDSC样细胞增加，G-MDSC样细胞增加、M-MDSC样细胞减少，脾MDSC样细胞CD11c、MHC II和CD86降低；巨噬细胞减少。结肠ZO-1和Occludin改善，结肠TNF-α、Arg1、IL-1β和IL-6降低，IL-10增强；血清IL-10升高，IL-6和IL-1β降低。其二，肠道菌群耗竭减弱BPNSs对关节炎的治疗效果。ABX处理本身部分改善CIA，但ABX条件下BPNSs未产生额外爪肿胀减轻，未进一步改善BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N，Tb.Sp显著增加；HE和TRAP显示骨破坏未进一步减轻；脾和MLN中Treg、Th17比例及Treg/Th17比值无显著差异，支持肠道菌群对BPNSs疗效的重要贡献。其三，来自BPNSs处理CIA小鼠的FMT有助于改善关节炎。接受BPNSs处理供体菌群的CIA小鼠关节炎较对照轻；但FMT未重现直接BPNSs治疗对MDSC样细胞和巨噬细胞的调节，提示髓系细胞变化可能为直接ROS清除相关而非菌群依赖；Treg比例和Treg/Th17比值仍升高、Th17降低，支持菌群改变通过Treg/Th17平衡改善关节炎。其四，BPNSs处理显著改变肠道菌群组成和结构。宏基因组测序显示α多样性Shannon和Simpson指数降低，PCoA和NMDS明显聚类；Bacteroidota减少、Bacillota增加，F/B比值升高；Epsilonproteobacteria、Campylobacterales、Helicobacteraceae和Helicobacter上调，Coriobacteriia、Deferribacteres、Prevotellaceae、Barnesiellaceae、Eggerthellaceae、Mucispirillaceae及Alistipes、Lepagella、Barnesiella、Prevotella、Paramuribaculum下调。LEfSe显示BPNSs组富集Lachnospiraceae_bacterium_A2、Helicobacter_ganmani和bacterium_D16?59，其中Lachnospiraceae_bacterium_A2与MLN Treg频率升高相关。其五，BPNSs重塑肠道代谢景观并增加粪便KYNA丰度。非靶向代谢组学显示PLS-DA明显聚类，BPNSs上调79种、下调118种代谢物；IAA和IPA无显著差异，KYNA显著增加；KYNA与关节炎评分负相关，并与s_bacterium_D16-59、s_bacterium_D16-54、s_bacteria_unclassified正相关。其六，KYNA通过AhR抑制mTORC1激活促进Treg细胞分化。分子对接显示KYNA与AhR配体结合口袋预测结合能?6.487 kcal/mol，与IPA、IAA相当；体外KYNA剂量依赖增加Treg比例，AhR拮抗剂CH-223191减弱该作用；GSEA显示AKT信号通路富集；Western blot显示KYNA不改变AKT、mTOR、p70 S6K、4E-BP1总蛋白，但降低其磷酸化并上调FOXP3。其七，KYNA通过AhR通路缓解关节炎。CIA小鼠中KYNA显著缓解关节炎症，CH-223191加重炎症并抵消KYNA对骨参数、组织学、破骨细胞、Treg/Th17平衡及结肠Occludin和ZO-1的改善；IEC-6细胞体外实验一致，表明KYNA通过AhR通路调节全身Treg/Th17平衡并抑制局部关节炎症和骨破坏。

讨论部分总结：该研究提出靶向清除肠道ROS治疗RA的新策略，发现清除肠道ROS改善关节炎依赖微生物代谢物KYNA作为生态位信号激活AhR，驱动幼稚CD4⁺ T细胞向Treg分化。研究更新了ROS影响免疫稳态的认识，揭示“ROS清除–KYNA–Treg轴”；直接BPNSs治疗引起的MDSC相关变化未在FMT中重现，提示其可能为平行反应而非主要可转移菌群依赖机制。宏基因组显示BPNSs显著重塑肠道菌群生态并提高F/B比值，Lachnospiraceae_bacterium_A2富集与MLN Treg升高密切相关。色氨酸代谢是宿主代谢、肠道菌群和免疫调节的关键界面，KYNA通过AhR重设Treg/Th17平衡；临床上RA患者血清KYNA水平较健康对照显著降低。研究也指出局限：KYNA精确代谢来源未明；MDSC样细胞主要为表型分析，未直接验证抑制能力；AhR证据主要为药理学而非遗传学；BPNSs药代、长期生物安全和最佳剂量需评估；BPNSs给药始于关节炎临床发作前，主要评价预干预效应。结论部分翻译：总之，本研究提出通过靶向清除过量肠道ROS治疗RA的新策略。研究人员证明，清除肠道ROS显著改善肠道微生态稳态，色氨酸衍生代谢物KYNA显著上调发挥核心作用。机制上，升高的KYNA激活AhR，随后调节mTORC1信号通路并上调转录因子FOXP3表达，从而促进Treg细胞分化和功能。该级联通过增强免疫耐受有效缓解RA进展。总体而言，这些发现提供了肠道菌群衍生代谢物与宿主免疫调节在RA中串扰的直接实验证据，强调“肠–免疫–骨”轴的治疗相关性，并提供有前景的微生物靶向RA治疗途径。