《International Journal of Nanomedicine》：Sequential Barrier Navigation by Yeast β-Glucan-Engineered Liposomal Nanovaccines Potentiates Oral Melanoma Immunotherapy
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目的：口服递送的蛋白质抗原面临胃肠道降解以及通过黏液、肠上皮进入抗原呈递细胞（APCs）的低效转运问题。为应对这些屏障，研究人员开发了YGB@OVA/PBA-C-LIPs，一种负载卵清蛋白（OVA）的阳离子脂质体纳米疫苗，其表面包被酵母β-葡聚糖（YGB）并功
目的：口服递送的蛋白质抗原面临胃肠道降解以及通过黏液、肠上皮进入抗原呈递细胞（APCs）的低效转运问题。为应对这些屏障，研究人员开发了YGB@OVA/PBA-C-LIPs，一种负载卵清蛋白（OVA）的阳离子脂质体纳米疫苗，其表面包被酵母β-葡聚糖（YGB）并功能化修饰苯硼酸（PBA）。
方法：研究人员表征了YGB@OVA/PBA-C-LIPs的理化性质，并在体外评估了其黏液和上皮转运、巨噬细胞摄取、OVA交叉呈递及免疫激活能力。采用昆布多糖竞争实验评估β-葡聚糖敏感性摄取。在荷B16-OVA小鼠口服给药后，检测了胃肠道滞留、免疫应答、抗肿瘤活性及耐受性。
结果：YGB@OVA/PBA-C-LIPs平均直径为127.5 ± 0.8 nm，OVA包封率为83.17 ± 1.98%，且在4°C储存12天内粒径无明显增大。该制剂改善了在模拟黏液层和Caco-2/Raji B模型中的转运，并增强了RAW264.7巨噬细胞的摄取；昆布多糖减弱了这一优势，证实了摄取的β-葡聚糖敏感组分。该制剂还增加了DC2.4细胞表面CD80和H-2Kb-SIINFEKL水平，以及在DC2.4-脾细胞共培养中的IFN-γ释放。单次口服剂量后，Cy7标记的制剂在72小时仍可在腹部检测到。重复给药后，与未治疗的荷瘤对照组相比，肿瘤重量减少了75.0%（0.36 ± 0.11克对比1.44 ± 0.23克），血清OVA特异性IgG反应性升高至对照值的3.8倍。主要器官组织学未见明显异常。
结论：YGB/PBA双功能化制剂结合了胃肠道保护和黏膜转运，同时增强了APCs对抗原的呈递，从而在B16-OVA模型中改善了免疫应答和肿瘤控制。需要使用临床相关的肿瘤抗原进行验证，以确立更广泛的治疗相关性。
研究背景、存在问题与研究意义
黑色素瘤是一种免疫原性恶性肿瘤，也是免疫检查点阻断治疗的主要临床应用场景。尽管含纳武利尤单抗的方案在某些患者中显示出持久的疗效，但原发性及获得性耐药仍是重要的局限性。治疗性癌症疫苗通过诱导或扩增针对肿瘤相关或肿瘤特异性抗原的免疫应答，提供了一种互补策略。对于蛋白质抗原疫苗而言，其效力取决于抗原完整性的保持、递送至抗原呈递细胞（APCs）以及进入有效的抗原呈递途径的胞内分选。纳米载体可以保护抗原、促进其向APCs递送并共同递送免疫调节组分，但其性能在很大程度上依赖于载体的组成和表面性质。
口服给药已被探索作为癌症疫苗接种的途径。与静脉注射的纳米颗粒不同，口服制剂首先遇到胃肠道腔。在穿越管腔屏障后，口服抗原可能接触肠道相关淋巴组织，包括派尔集合淋巴结。微皱褶细胞（M细胞）参与管腔抗原采样并将抗原转移至下方的免疫细胞。口服蛋白质疫苗的一个主要限制是在产生有效的免疫识别之前，完整抗原会逐步丧失。这种序贯抗原丧失发生在三个相连的阶段：（i）胃肠道暴露，（ii）通过黏液和肠上皮（包括M细胞相关采样）的通道，以及（iii）APCs摄取和胞内抗原加工。胃酸、消化酶、胆汁盐和肠液可能在抗原到达免疫细胞前使其失稳。随后，纳米颗粒必须穿越黏液屏障，而黏液的粘附和粘弹性特性可限制其接近上皮表面。上皮转运进一步受到M细胞丰度相对较低的限制。在APCs摄取后，内吞途径和胞内区室化决定了可溶性抗原是进入MHC-I交叉呈递还是溶酶体MHC-II呈递途径。因此，口服蛋白质纳米疫苗应跨越这些连接阶段进行评估，而非仅针对单个递送步骤。
先前的研究已分别探讨了基于脂质的口服疫苗、β-葡聚糖相关免疫相互作用、M细胞靶向以及PBA辅助口服递送的可行性，但它们涉及不同的货物、载体架构和实验终点。将酵母β-葡聚糖（YGB）涂层与PBA功能化的阳离子脂质体整合用于口服蛋白质抗原递送，在胃肠道保护、黏液和上皮转运、APCs摄取及抗原交叉呈递方面的综合评估尚不充分。因此，本研究的贡献在于这些组分的功能性整合及其跨连接的递送和APCs相关终点的评估。
主要关键技术方法
研究人员采用薄膜水化法制备脂质体，并通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征粒径、电位及形态。利用模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）评估胃肠道稳定性。建立模拟黏液层和Caco-2/Raji B共培养M细胞样上皮模型，评价跨屏障转运。采用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析RAW264.7细胞摄取及胞内分布，并通过昆布多糖竞争实验验证Dectin-1介导的摄取机制。利用SKCM_GSE72056等公共黑色素瘤单细胞转录组数据集分析CLEC7A/Dectin-1的表达模式，并结合分子对接预测β-葡聚糖与Dectin-1的结合。在DC2.4细胞中检测表面CD80和H-2Kb-SIINFEKL复合物水平，并通过DC2.4-脾细胞共培养评估IFN-γ释放。最后，在皮下接种B16-OVA细胞的C57BL/6小鼠模型中，通过口服给药评估抗肿瘤活性和免疫应答。
研究结果
理化性质及OVA保留与释放：YGB@OVA/PBA-C-LIPs的平均水合粒径为127.5 ± 0.8 nm，呈现窄分布和集中的zeta电位。透射电镜显示近球形形态，无显著聚集。在模拟胃液（pH 1.2）和模拟肠液（pH 7.6）中，YGB@OVA/PBA-C-LIPs的剩余包封率显著高于未包被的OVA/PBA-C-LIPs，表明YGB涂层提供了优越的OVA保留能力。体外释放分析显示OVA从制剂中逐渐释放，呈现持续释放特征。
光谱表征、胶体稳定性与血液相容性：紫外-可见吸收光谱验证了OVA加载和PBA功能化。在4°C储存120小时内粒径和zeta电位相对稳定，在PBS、SGF、SIF及胎牛血清（FBS）中均未观察到明显沉淀或相分离。溶血率低于2%，在PBS和FBS中24小时内粒径变化极小，12天储存期内无显著增大。
细胞相容性与模拟黏液层转运：CCK-8实验显示，YGB@OVA/PBA-C-LIPs在高达100 μg/mL的OVA等效浓度下，RAW264.7和FHC细胞活力均保持在80%以上。在模拟黏液层模型中，两种含PBA的制剂（OVA/PBA-C-LIPs和YGB@OVA/PBA-C-LIPs）在接收室产生更高的荧光信号，且在黏液层内的荧光保留较少，相对穿透效率超过80%，显著高于不含PBA的制剂（低于50%），表明PBA修饰减少了黏液滞留并促进了跨模型屏障的运输。
Caco-2/Raji B共培养模型的跨上皮转运：通过监测跨上皮电阻（TEER）确认了M细胞样上皮模型的成功建立。与Caco-2单层相比，Caco-2/Raji B共培养模型中基侧室的荧光更高。在2、4和6小时时间点，YGB@OVA/PBA-C-LIPs的相对转运效率均显著高于OVA/PBA-C-LIPs，表明YGB涂层进一步增强了M细胞介导的跨上皮转运。
CLEC7A/Dectin-1分析支持YGB介导免疫识别的生物学相关性：在SKCM_GSE72056单细胞数据集中，CLEC7A表达主要在单核/巨噬细胞群体中富集，而在恶性细胞和大多数淋巴细胞中表达较低。在其他黑色素瘤单细胞数据集中也观察到类似的富集模式。分子对接显示β-葡聚糖能够与Dectin-1的识别区域结合，并与关键残基（Asn-154, Asp-159, Lys-129, Ser-130, Lys-244）形成潜在氢键相互作用。
YGB涂层增强RAW264.7的Dectin-1相关摄取：共聚焦成像显示，YGB@OVA/PBA-C-LIPs在2、4和6小时的细胞相关DiI荧光强度均显著高于OVA/PBA-C-LIPs。流式细胞术证实了YGB@OVA/PBA-C-LIPs更高的摄取量。昆布多糖预处理降低了YGB@OVA/PBA-C-LIPs的摄取优势，但对OVA/PBA-C-LIPs影响甚微，支持Dectin-1参与YGB介导的识别。
PBA功能化减少溶酶体共定位并增强OVA交叉呈递：与YGB@OVA/C-LIPs相比，YGB@OVA/PBA-C-LIPs在6和8小时与LysoTracker Red标记的溶酶体共定位逐渐减少，Pearson相关系数更低，在8小时达到统计学显著性。在DC2.4细胞中，YGB@OVA/PBA-C-LIPs产生了最高的表面CD80和H-2Kb-SIINFEKL复合物的中位荧光强度。在与脾细胞的共培养中，经YGB@OVA/PBA-C-LIPs脉冲处理的DC2.4细胞引发了各制剂组中最高的IFN-γ释放。
口服免疫YGB@OVA/PBA-C-LIPs延缓B16-OVA黑色素瘤进展：在第21天终点，YGB@OVA/PBA-C-LIPs组的平均肿瘤重量为0.36 ± 0.11 g，而生理盐水处理的荷瘤对照组为1.44 ± 0.23 g，减少了75.0%。YGB@OVA/PBA-C-LIPs组的肿瘤生长最慢。所有组的小鼠体重在研究期间均逐渐增加。
重复口服给药后主要器官未见明显组织病理学异常：心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的苏木精-伊红（H&E）染色切片在各制剂治疗的荷瘤组和健康对照组中均未见明显组织病理学异常。
YGB@OVA/PBA-C-LIPs延长胃肠道滞留并增强抗原特异性免疫应答：全身荧光成像显示，两种YGB包被制剂的腹部信号比OVA/PBA-C-LIPs更强且更持久，YGB@OVA/PBA-C-LIPs在72小时仍可检测到。YGB@OVA/PBA-C-LIPs组在脾脏中产生最大的CD4+阳性面积，在肿瘤中产生最大的CD8+阳性面积，均显著高于其他制剂组。该组还拥有最高的血清IFN-γ浓度，OVA特异性IgG反应性约为生理盐水处理荷瘤对照组的3.8倍。血清IL-6低于荷瘤对照组和其他比较制剂组，但仍高于健康对照组水平。血清TNF-α在YGB@OVA/PBA-C-LIPs组最高。
讨论总结
口服递送蛋白质纳米疫苗的根本限制在于抗原在胃肠道转运过程中的降解以及向APCs的低效递送。本研究开发的YGB@OVA/PBA-C-LIPs旨在保护OVA免受胃肠道降解，并改善黏膜转运和APCs摄取。结果表明，YGB涂层限制了抗原在胃肠道暴露期间的损失，PBA改善了跨模拟黏液层的转运并与较低的溶酶体共定位相关，而YGB涂层以昆布多糖敏感的方式增强了RAW264.7的摄取。双功能化制剂还增加了OVA交叉呈递，并在重复口服给药后延缓了B16-OVA肿瘤生长。这些结果支持YGB@OVA/PBA-C-LIPs可能减轻口服蛋白质抗原递送多个关键阶段的序贯OVA损失，包括胃肠道转运、黏液穿透、M细胞介导的跨上皮转运、RAW264.7巨噬细胞摄取及胞内抗原加工。组合的YGB/PBA功能化使脂质体制剂能够将早期的抗原保护与后续的屏障转运和免疫细胞相互作用耦合起来。
研究结论翻译
本研究提出了一种双功能化脂质体策略，解决了口服给药后细胞外递送屏障和胞内抗原加工问题。通过将PBA介导的跨模拟黏液层转运与YGB相关的免疫识别相结合，YGB@OVA/PBA-C-LIPs改善了OVA保留、APCs摄取和交叉呈递、系统性免疫应答以及对B16-OVA黑色素瘤的控制。这些发现支持对该平台用于口服递送蛋白质肿瘤抗原的进一步评估，包括使用临床相关的黑色素瘤抗原以及与其它免疫疗法联合的研究。
