重组腺相关病毒载体基因组的CpG甲基化特征与免疫原性研究

《Viruses》：DNA Methylation Profiling of rAAVs Reveals Hypomethylated Genomes and Evidence for Predominant Packaging of Replicated Genomes

摘要

针对重组腺相关病毒载体（rAAV）的免疫反应会削弱基因疗法的疗效。全身给药时引发这些免疫反应的触发因素之一是载体基因组中未甲基化的胞嘧啶–磷酸–鸟嘌呤（CpG）基序对Toll样受体9的激活。为了更好地理解rAAV的表观遗传特征，我们对通过标准三重转染或稳定细胞系制备的载体基因组进行了亚硫酸氢盐测序。此外，我们通过在三维三重转染中使用体外甲基化的质粒，研究了模板DNA的表观遗传状态是否影响被包裹的基因组。研究结果表明，无论采用哪种生产平台，rAAV基因组均缺乏明显的CpG甲基化。值得注意的是，即使使用完全CpG甲基化的模板质粒，所得载体DNA的甲基化水平也仅为4.56%，这表明降低CpG相关免疫原性需要超越模板DNA修饰的替代策略。此外，比较由GpC甲基化和CpG甲基化质粒产生的rAAV的甲基化模式发现，载体基因组主要在基因组复制后被封装，而非直接从质粒DNA中封装。这些发现为rAAV封装机制提供了重要见解，并为未来的载体工程策略提供了参考。