《Journal of Inflammation Research》：Network Pharmacology and Experimental Evidence Indicate That Dihydrochelerythrine from Toddalia asiatica Ameliorates Pathological Features of Knee Osteoarthritis in Rats and Is Associated with PI3K/AKT Signaling
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背景：飞龙掌血（Toddalia asiatica）被用于治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis, KOA）的中成药中，但其活性成分和实验基础尚未完全明确。本研究探讨二氢白屈菜红碱（dihydrochelerythrine, DHCHE）是否能
背景：飞龙掌血（Toddalia asiatica）被用于治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis, KOA）的中成药中，但其活性成分和实验基础尚未完全明确。本研究探讨二氢白屈菜红碱（dihydrochelerythrine, DHCHE）是否能改善实验性KOA的结构和分子变化。
方法：通过网络药理学和分子对接筛选活性化合物和候选靶点。雄性Sprague-Dawley大鼠在模型诱导后7天开始，每日一次口服灌胃给予DHCHE（2.5或5 mg/kg），持续28天。采用微型计算机断层扫描（micro-computed tomography, micro-CT）、苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining, HE）、番红O-固绿染色（Safranin O-fast green staining）及阳性面积定量、蛋白质印迹法（Western blotting）评估膝关节。
结果：网络药理学优先筛选出DHCHE，其中AKT1、EGFR和SRC位列核心靶点。碘乙酸单钠（monosodium iodoacetate, MIA）诱导的KOA显著破坏软骨下骨微结构。骨体积分数（BV/TV）和骨密度（BMD）低于Sham组，而结构模型指数（SMI）升高（均P < 0.001）；骨小梁数量（Tb.N）降低、骨小梁分离度（Tb.Sp）增加（均P < 0.01）。DHCHE减轻了这些变化，且5 mg/kg剂量下更多指标得到改善。KOA大鼠番红O阳性软骨面积的丢失也被部分逆转。蛋白质印迹法显示高剂量下反应更广泛。5 mg/kg DHCHE治疗降低了p-PI3K、p-AKT和PI3K（均P < 0.001），以及p-EGFR（P = 0.0012）和EGFR（P = 0.0054）。在2.5 mg/kg剂量下，p-AKT（P = 0.0037）和PI3K（P < 0.001）显著降低。
结论：DHCHE改善了MIA诱导的KOA大鼠软骨下骨微结构和软骨病理变化。伴随的磷酸化EGFR、PI3K和AKT信号降低与该信号轴相关，但未建立直接靶点结合和因果关系。
膝骨关节炎（KOA）是一种累及全关节的疾病，涉及关节软骨退变、软骨下骨重塑、滑膜炎症、骨赘形成以及半月板和髌下脂肪垫的改变，其发病与年龄、性别、肥胖、遗传易感性、既往关节损伤和力学负荷改变等因素相关。近期多组学孟德尔随机化分析亦将程序性细胞死亡通路与骨关节炎易感性联系起来。疼痛、僵硬和进行性功能丧失可显著限制日常活动。非甾体抗炎药虽能短期缓解症状，但长期使用受限于心血管和胃肠道不良反应。基于传统中药的干预措施已在KOA中有所研究，但不同制剂和模型中的组成及证据支持程度各异。飞龙掌血（Toddalia asiatica）被用于多种治疗风湿痹痛和膝痛的中成药中，具有抗炎和镇痛作用报道。既往对飞龙掌血的研究主要集中于类风湿性或炎性关节炎，其活性成分尚未在KOA模型中进行系统评估。因此，研究人员采用网络药理学优先筛选化合物和靶点，随后进行分子对接和DHCHE的体内评估，实验工作考察了软骨下骨微结构、软骨组织病理学及EGFR/PI3K/AKT相关蛋白表达。
研究人员开展了以下研究：通过网络药理学从飞龙掌血中筛选出16种候选成分，与KOA相关基因取交集获得187个靶点，构建“草药-成分-靶点”网络，其中Arnotianamide和DHCHE具有最高的成分节点度。通过STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用网络并进行拓扑筛选，确定38个核心靶点，AKT1、EGFR和SRC位列中心节点。基因本体（GO）富集分析显示主要生物学过程包括对肽激素的反应、对肽激素刺激的细胞反应和对血管内皮生长因子刺激的细胞反应；KEGG富集分析将PI3K-AKT信号通路列为排名靠前的通路之一。分子对接显示DHCHE与AKT1（?8.70 kcal/mol）、SRC（?6.51 kcal/mol）和EGFR（?5.95 kcal/mol）具有较低的预测结合能。随后在碘乙酸单钠（MIA）诱导的KOA大鼠模型中，于模型诱导后7天开始每日口服灌胃DHCHE（2.5或5 mg/kg）持续28天，通过微型计算机断层扫描（micro-CT）、组织病理学染色和蛋白质印迹法评估治疗效果。
研究结果显示：micro-CT和肉眼标本显示Sham组骨小梁排列规则，KOA组骨小梁稀疏且紊乱。与Sham组相比，KOA大鼠骨体积分数（BV/TV）和骨密度（BMD）降低（P < 0.001），骨小梁数量（Tb.N）降低、骨小梁分离度（Tb.Sp）增加（P < 0.01），结构模型指数（SMI）升高（P < 0.001）。与KOA组相比，2.5 mg/kg DHCHE增加了BV/TV、Tb.N和BMD，降低了SMI和Tb.Sp（P < 0.05）；5 mg/kg剂量下BV/TV和Tb.N增加、SMI和Tb.Sp降低（P < 0.01），BMD增加（P < 0.05）。组织病理学方面，HE染色显示Sham组关节面光滑、软骨层次清晰，KOA组软骨层次不清、软骨细胞核固缩明显，两个DHCHE组均显示更好的组织结构保留。番红O-固绿染色显示KOA软骨阳性染色显著减少，DHCHE治疗后部分恢复，定量分析证实KOA组番红O阳性面积低于Sham组，两个DHCHE剂量组均部分恢复，且5 mg/kg剂量组阳性面积更大。蛋白质印迹法显示，与Sham组相比，KOA大鼠磷酸化和总PI3K、AKT和EGFR均升高（均P < 0.05）。2.5 mg/kg DHCHE降低了p-AKT（P = 0.0037）和PI3K（P < 0.001），而p-PI3K、p-EGFR、AKT和EGFR的变化不显著（均P > 0.05）。5 mg/kg剂量下反应更广泛，p-PI3K、p-AKT和PI3K均降低（均P < 0.001），p-EGFR（P = 0.0012）和EGFR（P = 0.0054）亦降低，总AKT保持不变（P > 0.9999）。
讨论部分指出，网络药理学将Arnotianamide和DHCHE列为领先化合物，DHCHE对AKT1、SRC和EGFR的预测结合能均低于另一候选化合物，因此选择DHCHE进行动物实验，但分子对接本身不能确定其为飞龙掌血的唯一关键成分。既往研究将AKT1与软骨细胞凋亡和OA进展联系起来，SRC家族信号与软骨细胞表型和基质调节相关，EGFR信号与软骨稳态相关。micro-CT数据显示MIA注射后软骨下骨小梁丢失和结构紊乱，DHCHE改善了多项指标，但横断面分析无法确定骨改变发生在软骨损伤之前还是之后。组织学显示DHCHE治疗后软骨组织结构改善和番红O阳性基质部分恢复，支持蛋白聚糖丰富软骨基质的保留。蛋白质印迹显示KOA大鼠EGFR/PI3K/AKT相关蛋白水平升高，5 mg/kg剂量降低了p-PI3K、p-AKT、p-EGFR、PI3K和EGFR，2.5 mg/kg剂量降低了p-AKT和PI3K，总AKT在两个剂量下均未改变。PI3K/AKT/mTOR信号通路已被涉及实验性软骨退变，PI3K/AKT激活也在另一实验性软骨退变模型中有报道。飞龙掌血在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中亦与PI3K/AKT/NF-κB改变相关。MAPK1和RELA出现在富集结果中，但本研究未测量NF-κB、MAPK和mTOR活性，直接结合、靶点特异性抑制和通路因果依赖性均未检测。炎症解释也需谨慎，本研究未测量滑膜细胞因子、炎性细胞浸润或全身炎症标志物。研究存在多项局限性：未评估DHCHE的体内代谢稳定性和药代动力学特征，两个测试剂量不足以定义完整剂量-反应关系，需要靶点特异性抑制剂或遗传干预来确定观察到的效应是否依赖于预测靶点，缺乏步态和负重测量、长期安全性评估和先验功效计算，软骨损伤虽通过番红O阳性面积评估但未进行验证的盲法OARSI评分，Arnotianamide和DHCHE未进行实验比较。
结论：本研究将网络药理学与实验验证相结合，考察飞龙掌血来源的DHCHE在MIA诱导的KOA中的潜在作用。DHCHE改善了大鼠软骨下骨微结构损伤和软骨病理变化，这些效应伴随EGFR/PI3K/AKT信号轴内磷酸化水平的降低。在得出治疗或临床结论之前，需要进一步的靶点特异性和功能研究。
