《Animals》：Blood DNA Methylation Responses to Seasonal Environmental Variation in the Giant Panda (Ailuropoda melanoleuca): A Whole-Genome Bisulfite Sequencing Analysis of Multiple Individuals Across Multiple Time Points
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季节性环境变化是野生动物普遍面临的一种应激源，可诱导DNA甲基化的可塑性变化。血液DNA甲基化是整体生理状态的综合性分子指标，但大熊猫血液甲基化的季节性动态仍不清楚。本研究旨在描绘自然野外条件下大熊猫全基因组血液甲基化模式，揭示其季节性适应背后的表观遗传策略。
季节性环境变化是野生动物普遍面临的一种应激源，可诱导DNA甲基化的可塑性变化。血液DNA甲基化是整体生理状态的综合性分子指标，但大熊猫血液甲基化的季节性动态仍不清楚。本研究旨在描绘自然野外条件下大熊猫全基因组血液甲基化模式，揭示其季节性适应背后的表观遗传策略。研究人员于2023至2025年间，从大相岭自然保护区三只野化训练大熊猫的冬季（n = 6）和夏季（n = 6）共采集12份血液样本，并进行全基因组亚硫酸盐测序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）。全基因组mC/C比率（4.18%–4.98%）以CG序列背景为主导。冬夏比较鉴定出7113个差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs）和3063个差异甲基化基因（differentially methylated genes, DMGs）。这些基因富集于转录调控、细胞表面受体信号转导、miRNA代谢以及MAPK、Ras和T/B细胞受体信号通路。冬季高甲基化基因同时富集于免疫防御和能量消耗过程，而冬季低甲基化基因富集有限，表明高甲基化介导的抑制在季节性适应中占主导地位。本研究首次揭示大熊猫血液中一种以"夏季免疫增强、冬季能量保存"为特征季节性甲基化指纹。由于样本采集于自然栖息地，这些差异反映了对温度、光周期、食物可得性和病原压力的整合性表观遗传响应，而非单一因素效应。这些发现为濒危哺乳动物的季节性适应提供了分子证据，并为圈养大熊猫管理和野放评估提供了候选标记。
研究背景与科学问题
季节性环境变化是野生动物在自然栖息地面临的最普遍且最复杂的应激源之一。随着季节更替，光周期、环境温度、降水与湿度、食物资源丰度与质量以及寄生虫和其他病原体的活动均发生系统性协同变化，共同塑造动物栖息地的季节性环境格局。为应对这种多因素季节性压力，动物在行为、生理和分子水平上进化出复杂的适应策略。
大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是受季节性环境应激源影响的典型代表。其栖息地具有显著季节性特征——冬季寒冷干燥、夏季温暖潮湿。冬季低温与食物匮乏对能量稳态维持构成压力，而夏季温暖潮湿的气候则有利于外寄生虫和内寄生虫的生存与传播，在免疫层面加剧健康风险。大相岭自然保护区大熊猫的蜱虫负荷在夏季达到高峰，佛坪自然保护区胃肠道蛔虫（Baylisascaris schroederi）感染强度也呈现暖季高峰。通过长期适应性进化，大熊猫在觅食行为、活动节律和能量预算方面均表现出显著季节性调整，但驱动这些季节性适应表型的分子调控机制，尤其是表观遗传响应模式，仍 largely 未知。
DNA甲基化是真核生物中最稳定且研究最充分的表观遗传修饰之一，在维持基因组稳定性、调控基因表达和介导细胞分化中发挥核心作用。作为连接环境、基因型和表型的关键分子枢纽，DNA甲基化对多种环境刺激敏感响应。已有跨物种研究证明，温度、光周期和病原体均可诱导DNA甲基化重塑，且其介导的适应机制从鱼类到哺乳动物具有进化保守性。然而，大多数证据来自受控实验或模式动物及经济动物，大型野生哺乳动物在自然栖息地中季节性表观遗传响应的直接证据极为稀缺。
大熊猫DNA甲基化研究已取得初步进展：已生成脑、肝、胰等组织的单碱基分辨率甲基化图谱，开展了白内障老年圈养大熊猫与健康个体的比较甲基化分析，并利用全基因组亚硫酸盐测序构建了年龄相关血液DNA甲基化动态图谱。然而，关于野生动物——尤其是濒危大型哺乳动物——在自然栖息地对季节性环境变化的表观遗传响应研究仍极为有限。由于无法对完全野生大熊猫进行重复采血，生活在近自然条件下的野化训练个体成为研究野外条件下季节性DNA甲基化动态的最可行替代对象。血液因循环全身且与免疫、内分泌和代谢系统功能耦合，其DNA甲基化可提供机体整体生理状态的分子读数，且是大熊猫纵向表观遗传监测唯一可行的样本基质。
基于此，本研究聚焦大相岭自然保护区自然野外条件下的野化训练大熊猫，利用WGBS技术对连续三年夏季和冬季采集的血液样本进行单碱基分辨率甲基化组分析，旨在系统表征大熊猫血液DNA甲基化组特征，鉴定冬夏间季节性差异甲基化区域和基因，并通过基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析揭示季节性甲基化变异涉及的生物学过程和信号通路，阐明大熊猫应对季节性环境应激的潜在表观遗传调控策略。
主要技术方法
研究人员从四川大相岭大熊猫野化放归研究基地（海拔2410–2560米）采集三只健康成年雌性野化训练大熊猫（编号Q、H、X）2023至2025年间共12份血液样本，每只个体每年各采集冬季（平均温度?5 °C）和夏季（平均温度15 °C）样本一份，形成六个冬夏配对。样本经EDTA抗凝后?80 °C保存。提取基因组DNA后，以0.5% lambda DNA作为亚硫酸盐转化对照，经超声波打断至200–400 bp，使用EZ DNA Methylation-Gold Kit处理，构建Illumina TruSeq DNA甲基化文库，在Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序。生物信息学分析流程包括：使用FastQC和fastp进行质量控制；使用Bismark v0.24.0比对至大熊猫参考基因组（ASM200744v2）；使用DSS v2.12.0进行差异甲基化位点和区域鉴定；使用GOseq和KOBAS分别进行GO和KEGG富集分析。
研究结果
WGBS数据质量与基因组比对。 12个样本经质量过滤后每个获得3.42–5.08亿条清洁读段，清洁读段保留率超过96%，Q30碱基质量分数超过96%，GC含量为21.44%–22.12%。lambda DNA spike-in对照显示亚硫酸盐转化率为98.99%–99.71%。总比对率为83.51%–86.45%，唯一比对率为81.21%–83.99%，平均覆盖深度为22.35×–32.80×，基因组≥1×覆盖位点比例超过95%，满足DMR检测的深度要求。
全基因组甲基化特征。 全基因组甲基化比率（mC/C）为4.18%–4.98%，CG背景甲基化比率为67.19%–80.08%，CHG和CHH背景均低于0.1%，mCG占所有甲基化胞嘧啶的98.33%以上。CG背景中，内含子、3′UTR、重复区和外显子甲基化水平相对较高，启动子次之，5′UTR最低；近端启动子甲基化水平低于远端启动子。基因体及两侧2 kb区域分析显示，CG背景呈"基因体高、侧翼低"模式，CHG和CHH背景则相反。冬季和夏季组在各区域分布模式高度相似。
DMR特征。 冬夏比较共鉴定7113个DMRs，其中CG型占57.73%（4106个）且高甲基化明显占优，CHH型占40.74%（2898个）低甲基化略多，CHG型仅占1.53%（109个）。DMR长度51–1796 bp，88.77%集中在51–200 bp区间。通过注释共鉴定3063个DMGs，基因体区域2674个，启动子区域较少，CG型DMGs在两类区域均占绝对主导。
GO富集分析。 所有CG型DMGs获得81个显著富集条目，以转录调控相关条目最突出，发育形态发生、细胞表面受体信号通路、Wnt信号通路及miRNA代谢相关条目也显著富集。冬季高甲基化基因获得11个显著富集条目，包括DNA结合转录因子活性、转录调节因子活性以及pri-miRNA转录等miRNA代谢条目。冬季低甲基化基因未达显著阈值，但Toll样受体信号通路、先天免疫应答激活信号转导等免疫防御相关条目呈边缘富集趋势。
KEGG富集分析。 所有DMGs获得56条显著富集通路，集中于信号转导、细胞过程和免疫系统，轴突导向、Ras、MAPK、VEGF、Rap1、cAMP、钙信号通路以及Th17细胞分化、C型凝集素受体、Fc gamma R介导吞噬、T/B细胞受体信号通路等均显著富集。冬季高甲基化基因同样获得56条显著富集通路，除上述信号转导通路外，Th1和Th2细胞分化、自然杀伤细胞介导细胞毒性等免疫通路以及肌动蛋白细胞骨架调控、黏着斑等细胞连接通路也显著富集。冬季低甲基化基因仅获得5条显著富集通路，包括MAPK和Ras信号通路及三条疾病相关通路。
讨论与结论
本研究样本采集于自然野外栖息地，冬夏甲基化差异应被解释为对温度、光周期、食物资源和病原压力等多重并发环境因素的整合性表观遗传响应。在夏季免疫防御模块中，冬季高甲基化基因显著富集于Th17细胞分化、T/B细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导细胞毒性等免疫通路，表明这些通路在冬季相对高甲基化、夏季相对低甲基化，与夏季蜱虫等病原压力升高激活免疫防御、冬季病原压力降低抑制免疫以节省能量的生活史特征一致。在冬季能量保存模块中，冬季高甲基化基因同时显著富集于转录调控、MAPK/Ras/钙信号转导、肌动蛋白细胞骨架调控和黏着斑等能量消耗通路，表明冬季通过甲基化系统性抑制高能耗生物学过程。转录是细胞最耗能的过程之一，MAPK级联的磷酸化/去磷酸化、Ras GTPase循环和钙离子主动转运均依赖持续ATP消耗，冬季甲基化介导的抑制可协同降低信号转导的整体能量成本。冬季低甲基化基因富集有限，表明季节性适应中的主动调控主要表现为高甲基化介导的基因抑制而非低甲基化介导的基因激活，这与冬眠动物中观察到的"全局转录抑制"模式一致。
本研究存在以下局限：样本仅来自三只个体，个体数量有限制约了群体层面的推广性，但冬夏配对来自同一年同一只个体，内在控制了遗传背景和稳定个体特征；仅分析DNA甲基化层而未进行转录组测序，无法直接建立甲基化变化与基因表达改变之间的因果关系，功能解读基于通路水平富集推断，属于假说生成性质；受限于可采集血液量，血液学参数和血细胞类型组成无法评估。未来研究应整合RNA-seq数据系统阐明温度变化、DNA甲基化改变、基因表达调控和生理功能适应之间的完整分子通路，并扩大队列验证研究结果。
研究结论：本研究首次提供全基因组证据表明血液DNA甲基化介导大熊猫的季节性适应，凸显表观遗传调控作为濒危哺乳动物响应季节性环境变化的重要机制。研究结果表明，大熊猫血液DNA甲基化在季节性环境变化下发生广泛重编程，呈现"夏季免疫增强、冬季能量保存"的分化调控模式：冬季高甲基化基因富集于免疫防御相关通路，为夏季蜱虫等病原压力做准备；同时冬季高甲基化基因也富集于转录调控、信号转导和细胞骨架重组等高能耗通路，通过甲基化抑制这些过程以减少冬季能量支出。这一发现与野生大熊猫季节性环境压力的方向高度吻合，为濒危物种的表观遗传适应提供了新见解，也为圈养大熊猫的季节性健康管理和野放个体适应性评估提供了潜在分子标记和理论参考。
