Postbiotin-E8：源自Lacticaseibacillus sp. E8的新型抗菌后生元肽——抗菌、抗生物膜与食品保鲜潜力

《Applied Food Research》：Postbiotin-E8, a Novel Antimicrobial Postbiotic Peptide from Lacticaseibacillus sp. E8: Antibacterial, Antibiofilm and Food Preservation Potential

　　

Postbiotin-E8是一种来源于Lacticaseibacillus sp.的新型3.75 kDa后生元肽。经反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化后，该肽获得4.15倍纯化，回收率为29%。Postbiotin-E8表现出强效的杀菌活性和抗生物膜活性。Postbiotin-E8在多种理化条件下保持稳定。Postbiotin-E8改善了冷藏牛奶的品质并延长了其货架期。

研究背景：抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）已成为全球公共卫生和食品安全领域的重大挑战，多重耐药（Multidrug-Resistant, MDR）微生物持续增加，而新型抗生素研发管线不足。后生元（postbiotics）作为灭活微生物或其组分的制剂，因其稳定性、安全性和广谱抗菌特性而受到关注；其中蛋白类后生元如抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）和类细菌素抑制物质（bacteriocin-like inhibitory substances, BLIS）具有较好的理化稳定性。此外，生物膜（biofilm）形成是医疗和食品加工环境中的难题，胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质使菌群对消毒剂和抗菌药物耐受性增强。然而，已有后生元肽大多来自经典益生菌，环境微生物来源挖掘不足，且许多研究缺乏结构表征。为此，研究人员从环境来源Lacticaseibacillus sp. E8中分离、纯化并表征了一种新型后生元肽Postbiotin-E8，评价其抗菌、抗生物膜、杀菌活性及在冷藏牛奶中的保鲜潜力。

研究方法：研究人员在印度马哈拉施特拉邦的果蔬废弃物土壤与家禽废弃物土壤中采集样品，分离并鉴定菌株E8为Lacticaseibacillus sp.。经发酵、冷乙醇沉淀、透析、阳离子交换色谱（CIEC）及反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化；通过Tricine-SDS-PAGE、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、N端Edman降解、氨基酸组成分析及傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行结构表征；考察不同温度、pH、去污剂、酶和有机溶剂处理后的活性变化；以纸片扩散、琼脂孔扩散、刃天青（resazurin）微量稀释、结晶紫生物膜抑制和活菌计数法评价抗菌、杀菌和抗生物膜活性，并在4°C冷藏牛奶中评价保鲜效果。

研究结果：

3.1 菌株分离与筛选：从两类废弃物土壤中共分离获得6株形态不同的细菌（A1、B3、C2、D9、E8、F9），其中B3、C2、D9、E8对大肠埃希菌（Escherichia coli, E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）均表现出明显拮抗活性；E8和D9来源于果蔬废弃物土壤，B3和C2来源于家禽废弃物土壤，A1和F9的抑制作用可忽略。

3.2 菌株鉴定：16S rRNA基因测序显示，E8与Lacticaseibacillus属最相近菌株的序列一致性为96.19%，低于物种判定阈值；该序列已提交至NCBI GenBank，登录号为PX796476。B3、C2、D9分别与Bacillus sonorensis、Staphylococcus pasteuri和Bacillus subtilis最相近。

3.3 后生元产生与初步回收：E8发酵后获得约55 mL无细胞上清液；经冷乙醇沉淀和透析获得约35 mL部分纯化组分，且热处理后仍保留抗菌活性，提示活性成分为热稳定的蛋白类物质。

3.4 多步纯化：CIEC中抗菌活性集中在主要蛋白峰；RP-HPLC进一步得到单一对称主峰，冻干后获得稳定白色粉末，说明背景杂质被有效去除。

3.5 纯化参数：粗提物比活力为28.44 AU/mg，最终RP-HPLC纯化后升至118.16 AU/mg，纯化倍数4.15倍，总回收率29.09%；比活力逐级升高，证实活性肽被有效富集。

3.6 分子质量测定：Tricine-SDS-PAGE显示Postbiotin-E8分子量约3–4 kDa；MALDI-TOF MS在m/z 3749.55处出现[M+H]⁺主导峰；LC-MS确证完整分子量为3750.47 Da，表明该肽为单一、均质分子。

3.7 稳定性：Postbiotin-E8在40–50°C保持较强活性，80°C活性明显下降；pH 4.0–8.0范围内较稳定，pH 9.0时活性显著降低；对十二烷基硫酸钠（SDS）和EDTA的耐受性优于非离子表面活性剂（Tween 20/80、Triton X-100）和尿素；在乙腈和异丙醇中残留活性最高；对蛋白酶K、protease、pepsin和lysozyme部分敏感，对catalase和trypsin耐受，证实其蛋白本质和紧凑的分子结构。

3.8 氨基酸组成：PITC衍生化HPLC分析显示，甘氨酸（15.38%）含量最高，其次为赖氨酸（12.82%）、丝氨酸（10.26%）和缬氨酸（10.26%）；肽中同时含有疏水残基和带电残基，提示其可能形成两亲性结构。

3.9 N端测序：Edman降解法获得富含Gly、Lys、Ser和Val的N端序列；与已知抗菌肽数据库比对未发现完整同源序列，但与pediocin样IIa类细菌素plantaricin C19存在约80%局部相似性，支持Postbiotin-E8的新颖性。

3.10 FTIR光谱：谱图显示约3290 cm^?1处的N–H/O–H伸缩振动，1650–1540 cm^?1区间为酰胺I和酰胺II带，1450 cm^?1及1050–1000 cm^?1分别对应C–H弯曲和C–N伸缩振动，证实肽键结构。

3.11 体外抗菌、生长抑制、抗生物膜与杀菌动力学：

3.11.1 纸片扩散与琼脂孔扩散：Postbiotin-E8对E. coli、B. cereus和S. aureus的抑菌圈分别为19.0±1.0 mm、21.0±1.0 mm和23.0±1.0 mm；在100–300 μg/mL范围内，对S. aureus抑菌圈从12.4±0.4 mm增至21.5±0.6 mm，对S. Typhi从10.1±0.3 mm增至18.9±0.5 mm，呈剂量依赖性。

3.11.2 resazurin生长抑制：在7.8–1000 μg/mL范围内，Postbiotin-E8对S. aureus和S. Typhi的生长抑制率最高分别达61.61%±0.19%和64.00%±0.18%；浓度≥125 μg/mL时，S. Typhi较S. aureus更为敏感。

3.11.3 抗生物膜活性：结晶紫微板法显示，20–100 μg/mL时，Postbiotin-E8对S. aureus和S. Typhi生物膜形成的抑制率分别从20.00%±0.92%升至58.70%±1.54%，以及从25.10%±0.59%升至67.68%±1.34%，IC₅₀分别为91.30 μg/mL和73.73 μg/mL。

3.11.4 杀菌活性：24 h暴露后，Postbiotin-E8在31.25、62.5和125 μg/mL浓度下均使S. aureus活菌数完全降为0；对S. Typhi则在62.5和125 μg/mL下完全杀灭，31.25 μg/mL时仍存在残余活菌。

3.12 冷藏牛奶品质与货架期：在4°C储存10天，Postbiotin-E8处理组总活菌数增至约3.83 log₁₀ CFU/mL，pH保持在6.38；未处理和稀释剂对照组总活菌数升至约4.1 log₁₀ CFU/mL，pH降至约6.0，并出现浊度和异味。Postbiotin-E8延迟了可见腐败并改善感官评分（11/20），而nisin组效果最佳（14/20，未出现可见腐败）。

讨论与结论：研究人员认为，环境来源的Lacticaseibacillus sp. E8在16S rRNA水平与已知菌种差异显著，可能反映其对竞争性生态环境的适应性。逐级纯化有效富集了活性肽；结构分析表明Postbiotin-E8为含阳离子和疏水残基的两亲性小肽，特征与膜活性抗菌肽一致。其广谱抗菌、抗生物膜和杀菌结果支持其在食品接触表面消毒和生物防腐中的应用。在冷藏牛奶中，Postbiotin-E8能抑制腐败菌增殖和酸化，但效力低于nisin。研究结论为：Postbiotin-E8是由环境来源Lacticaseibacillus sp.产生的后生元肽，分子量约3.75 kDa，具有独特氨基酸序列和两亲性结构；该肽对S. aureus和S. Typhi具有抗菌活性、浓度依赖性生长抑制、抗生物膜和杀菌活性；同时改善了冷藏牛奶的微生物、理化、视觉和感官稳定性，具有作为天然生物防腐剂的潜力。其在多种理化条件下的稳定性支持食品及相关系统应用，但未来需进一步阐明其作用机制，评估安全性和细胞相容性，并在复杂食品基质和临床相关模型中验证效力。