美洲鲥（Alosa sapidissima）鱼卵源肽的超声辅助酶解制备与纯化：基于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）模型的抗氧化活性解析

《Applied Food Research》：Preparation and purification of egg-derived peptides from American shad ( Alosa sapidissima): revealing antioxidant properties in Caenorhabditis elegans

　　

美洲鲥（Alosa sapidissima）为溯河产卵鱼类，其鱼卵富含优质蛋白质，但人工繁育过程中超过80%的未受精卵被作为加工副产物废弃。本研究首次将超声辅助酶解技术应用于美洲鲥鱼卵蛋白，以制备生物活性肽。通过单因素实验和Box-Behnken响应面设计（RSM）优化酶解条件，确定最优参数为：超声功率166 W、超声时间13 min、碱性蛋白酶添加量3.4%、酶解时间1.8 h。在此条件下，水解物的肽含量、氧自由基吸收能力（ORAC）和血管紧张素转换酶（ACE）抑制率均达到最优。经超滤分离后，分子量小于3 kDa的肽组分（ASEP-U-Ⅳ）表现出显著的DPPH自由基清除活性（IC50=3.42 mg/mL）和ACE抑制活性（IC50=0.43 mg/mL）。采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）鉴定出500条肽序列，其中432条为3-7个氨基酸残基的短肽，推测这些短肽是主要生物活性的贡献者。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）体内实验中，ASEP-U-Ⅳ处理显著降低了脂褐素和丙二醛（MDA）水平，提高了超氧化物歧化酶（SOD）活性，并增强了线虫对H2O2氧化胁迫的抵抗能力。本研究不仅实现了美洲鲥鱼卵加工副产物的高值化利用，还为功能性食品开发中天然抗氧化肽的制备提供了绿色、高效的技术路径。

论文解读

一、研究背景与意义

美洲鲥（Alosa sapidissima）是一种溯河产卵鱼类，原产于北美，2003年引入中国进行人工养殖，以替代曾广泛分布于长江和钱塘江流域但自20世纪80年代末已消失的鲥鱼（Tenualosa reevesii）。随着人工繁殖技术的突破，美洲鲥在中国已形成商业化养殖规模，年产量估计达15000-20000吨。美洲鲥为分批产卵鱼类，每尾成熟雌鱼每季可产卵10万至40万粒，然而鱼卵孵化率通常低于20%，超过80%的未受精卵被作为加工副产物废弃，每年产生数百吨富含营养的鱼卵废弃物。营养分析表明，美洲鲥鱼卵粗蛋白含量达66.62%（干重），粗脂肪含量14.25%，总氨基酸和必需氨基酸分别占干物质的61.41%和27.05%，具有全面的氨基酸组成和合理的必需氨基酸比例。然而，尽管鱼卵蛋白资源优质，针对该物种鱼卵源生物活性肽的制备及其抗氧化活性研究此前几乎空白。将此类副产物转化为高附加值肽类产品，不仅能减少环境污染，还能促进水产养殖的可持续发展。

氧化应激是生物医学领域的核心研究方向之一。在健康生理条件下，体内活性氧（ROS）的产生与清除处于动态平衡；该平衡被打破即引发氧化应激，进而介导癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等病理过程。合成抗氧化剂（如BHA、BHT、TBHQ）虽高效廉价，但存在潜在毒性和致癌风险，已促使全球监管机构严格限制其在食品中的应用。相比之下，天然来源的抗氧化肽通过氢原子转移（HAT）和单电子转移（SET）等多重机制清除自由基，既能直接中和ROS，又能间接上调内源性抗氧化酶系统（如SOD、CAT、GPx），具有多靶点、低毒性的优势。此外，根据世界卫生组织2023年全球高血压报告，1990-2019年间全球高血压患者数量翻倍至13亿，预计2025年将达15.6亿。肾素-血管紧张素系统（RAS）是血压调节的关键机制，血管紧张素转换酶（ACE）在其中发挥核心作用，抑制ACE活性是重要的降压策略。然而传统ACE抑制剂和抗氧化药物常引起咳嗽、水肿等不良反应，促使研究者寻求更安全的天然替代品。秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为抗氧化和抗衰老研究的模式生物，具有生命周期短、繁殖力强、易于观察计数等优势，适合用于体内活性验证。因此，本研究首次采用超声辅助酶解技术从美洲鲥鱼卵中制备生物活性肽，并通过体外和体内实验系统评价其抗氧化及抗应激能力，兼具水产副产物高值化利用和功能性食品开发的双重意义。

二、关键技术方法

研究人员采用超声辅助酶解技术制备美洲鲥鱼卵肽。具体流程为：冻干鱼卵粉以1:70（w/v）固液比溶于蒸馏水，高速匀浆后使用JY92-IIDN超声细胞破碎仪（20 kHz，脉冲模式5 s开/5 s关，冰水浴控温低于10°C）进行超声预处理，随后调节pH至9.0，加入碱性蛋白酶于50°C下酶解。通过单因素实验筛选出超声功率、超声时间、酶添加量和酶解时间四个关键变量，以肽含量、氧自由基吸收能力（ORAC）和ACE抑制率为响应值，采用四因素三水平Box-Behnken响应面设计（BBD）进行优化。肽含量采用三氯乙酸沉淀法测定；ORAC以Trolox为标准物测定荧光衰减曲线下面积；DPPH和ABTS自由基清除活性分别在517 nm和734 nm波长下测定吸光度并计算IC₅₀值；ACE抑制率以马尿酸-组氨酰-亮氨酸（HHL）为底物测定。肽组分经超滤膜分离后，采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）进行肽序列鉴定。体内活性评价以秀丽隐杆线虫（C. elegans）为模型，检测脂褐素积累、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及对H₂O₂胁迫的抵抗能力。鱼卵样品由苏州鱼种生物技术有限公司提供。

三、研究结果

3.1 单因素实验与响应面优化

研究人员通过单因素实验考察了超声功率、超声时间、酶添加量和酶解时间对肽含量、ORAC值和ACE抑制率的综合影响，确定各因素的适宜范围后，采用Box-Behnken响应面设计建立四因素三水平优化模型。模型预测的最优水解条件为：超声功率166 W、超声时间13 min、碱性蛋白酶添加量3.4%、酶解时间1.8 h。在此条件下，三个响应指标均达到综合最优，验证实验与模型预测值吻合良好，表明该模型可靠有效。

3.2 肽组分分离与体外活性评价

将最优条件下制备的水解物经超滤分离，获得不同分子量范围的肽组分。其中分子量小于3 kDa的组分（ASEP-U-Ⅳ）表现出最强的体外抗氧化活性：DPPH自由基清除IC₅₀值为3.42 mg/mL，ABTS自由基清除能力亦显著；同时该组分表现出优异的ACE抑制活性，IC₅₀值达0.43 mg/mL。结果表明，低分子量肽组分是抗氧化和ACE抑制活性的主要贡献者，超声辅助酶解有效促进了低分子量活性肽的释放。

3.3 肽序列鉴定

采用HPLC-MS/MS对ASEP-U-Ⅳ组分进行肽组学分析，共鉴定出500条肽序列，其中432条为3-7个氨基酸残基的短肽。这些短肽中富含疏水性氨基酸（如Pro、Leu、Phe）和芳香族氨基酸（如Tyr、Trp），这些特征残基被认为通过氢键和疏水相互作用与自由基结合，是清除自由基的关键结构基础，推测其是观察到的抗氧化和ACE抑制活性的主要分子基础。

3.4 秀丽隐杆线虫体内抗氧化验证

以不同浓度的ASEP-U-Ⅳ处理秀丽隐杆线虫（C. elegans），检测多项氧化应激指标。结果显示：与对照组相比，ASEP-U-Ⅳ处理显著降低了线虫体内脂褐素（衰老标志物）和丙二醛（MDA，脂质过氧化产物）水平，同时提高了超氧化物歧化酶（SOD）活性。在H₂O₂氧化胁迫实验中，ASEP-U-Ⅳ预处理显著增强了线虫的存活率和应激抵抗能力。上述结果表明，美洲鲥鱼卵源肽在体内能够通过上调内源性抗氧化酶系统、减少氧化损伤产物积累，发挥系统性抗氧化保护作用。

四、讨论与结论

讨论部分指出，超声辅助酶解技术通过空化效应破坏蛋白质聚集体并暴露更多蛋白酶切割位点，从而提高了酶解效率和低分子量活性肽的释放量，这一绿色加工策略在鱼卵蛋白高值化利用中展现出显著优势。与合成抗氧化剂相比，天然来源的抗氧化肽通过直接清除自由基和间接上调内源性抗氧化酶系统的双重机制发挥作用，具有更全面的抗氧化防御能力和更低的毒性风险。分子量小于3 kDa的短肽组分（3-7个氨基酸残基）富含疏水性和芳香性氨基酸残基，这些结构特征与其自由基清除活性和ACE抑制活性密切相关。

研究结论：本研究首次建立了超声辅助酶解制备美洲鲥鱼卵生物活性肽的优化工艺，最优条件为超声功率166 W、超声时间13 min、碱性蛋白酶添加量3.4%、酶解时间1.8 h。所制备的<3 kDa肽组分（ASEP-U-Ⅳ）在体外表现出显著的DPPH自由基清除活性（IC₅₀=3.42 mg/mL）和ACE抑制活性（IC₅₀=0.43 mg/mL），在秀丽隐杆线虫（C. elegans）体内能够降低脂褐素和MDA水平、提高SOD活性并增强H₂O₂胁迫抵抗能力。该研究不仅为美洲鲥鱼卵加工副产物的高值化利用提供了绿色可行的技术路径，也为开发具有抗氧化和降压潜力的功能性食品原料奠定了科学基础。