手性农药顺式环吡酮胁迫下农业土壤的微生物演替与氮循环动态

《Applied Soil Ecology》：Microbial succession and nitrogen cycle dynamics in agricultural soil under stress from the chiral pesticide cis-epoxiconazole

　　摘要氮循环是农业土壤生物地球化学过程的重要组成部分，主要由常被忽视的微生物驱动。手性农药顺式环氧菌酮对农业土壤造成胁迫，但其对氮循环微生物的立体选择性效应知之甚少。在长期土壤培养实验中，顺式环氧菌酮对映体单体重塑了微生物群落的组成和结构，影响了酶活性和功能基因，从而影响了氮循环。具体来说，(?)-EPO处理富集了氮循环的关键宿主，并提高了β-葡萄糖苷酶和脲酶的活性，促进了氨氧化、异化硝酸盐还原为铵、固氮和氨化作用。相比之下，(±)-EPO处理增加了反硝化功能微生物（Gemmatimonadetes和Proteobacteria）和基因（narG和napA）的相对丰度，促进了反硝化作用，降低了氮的可用性。同时，(+)-EPO处理抑制了包括napA、nirK、nosZ、nirBD和nifH在内的关键基因以及脲酶活性的富集，导致土壤内氮素流动显著减少。本研究全面系统地分析了多种浓度的顺式环氧菌酮对农业土壤氮循环的影响。研究结果揭示了在手性农药实际应用条件下，氮循环基因图谱破坏和微生物调节胁迫相关的风险。引言氮循环在农业土壤的生物地球化学过程中起着至关重要的作用，是生产力和环境氧化还原平衡的关键中介（Passeport等，2011；Stüeken等，2016）。它也是促进土壤生态系统中各种营养物质循环的重要桥梁。氮循环包括硝化作用（NH??→NO??→NO??）、反硝化作用（NO??→NO??→NO→N?O→N?）、异化硝酸盐还原为铵（DNRA，NO??→NO??→NH??）、固氮（N?→NH?）、氨氧化（NH??→NH?OH→NO→NO??）、硝酸盐同化作用和氨化作用（有机氮→NH??）等过程（Shi等，2022；Zhang等，2020）。长期研究强调，微生物群落作为氮循环和更广泛生物地球化学过程的核心驱动因素常常被忽视（Peixoto等，2024）。这些群落对于预测农业土壤未来生态系统变化至关重要（Philippot等，2013；Zhao等，2014）。因此，理解微生物群落驱动农业土壤氮循环的响应模式及其潜在机制已成为理论研究和实际应用关注的焦点（Su等，2019a）。农业土壤是研究微生物群落驱动氮循环机制的热点领域，也是研究农药残留的重要对象（Su等，2019b）。随着全球人口增长和粮食需求增加，农业生产中使用更新、更多样化的农药也相应增加（Jeschke，2017）。统计表明，全球市场上约有28%的农药为手性农药，而在中国，这一比例升至40%，其中大多数以外消旋混合物的形式施用（Xu等，2018；Ye等，2015）。在这些农药中，环氧菌酮（EPO）是最广泛使用的杀菌剂之一，因其高效、持效期长和强吸附性而受到重视，对枯萎病、白粉病和疮痂病等疾病有效（Alexandrino等，2020；Xu等，2018；Ye等，2015）。结构上，顺式环氧菌酮是一种具有碳手性中心的手性化合物，产生两种对映异构体：2R,3S-(+)-顺式环氧菌酮和2S,3R-(?)-顺式环氧菌酮（Kaziem等，2021）。研究表明，环氧菌酮具有较长的环境持久性，在土壤中的自然降解半衰期范围为52至1500天（Kaziem等，2020；Passeport等，2011）。此外，顺式环氧菌酮已被鉴定为具有基因毒性的内分泌干扰物，并被归类为潜在的人类致癌物（Lewis等，2016；Pinto等，2018）。鉴于其风险，欧盟于2020年明确禁止使用环氧菌酮（https://sitem.herts.ac.uk/aeru/iupac/Reports/267.htm）（Lauschke等，2021）。然而，在中国，其使用仍然被允许，且尚未建立标准化的使用指南。手性农药通常表现出立体选择性，即一种对映体对目标生物表现出更高的活性，而另一种则施加更大的环境胁迫（de Albuquerque等，2018）。同样，顺式环氧菌酮的对映体在环境行为、生物毒性以及对营养循环调节的影响方面存在显著差异。研究表明，与(?)-EPO相比，(+)-EPO在土壤、植物和水生环境中具有更长的半衰期、更强的持久性和更高的生物毒性（Liang等，2012；Shi等，2022）。对映体之间的生物累积模式也不同，(+)-EPO主要在斑马鱼中累积，而(?)-EPO在蚯蚓中表现出优先富集（Wang等，2017；Xue等，2022a）。(+)-EPO驱动土壤细菌和真菌群落的结构变化，并立体选择性地破坏涉及磷酸盐、氨基酸和不饱和脂肪酸的代谢途径，且效应因浓度而异（Xue等，2022b）。此外，研究表明，顺式环氧菌酮显著破坏农业土壤中的自然氮循环（Xue等，2022b）。例如，Du等（2022）报道，环氧菌酮下调了nifH和AOB-amoA基因的相对丰度，同时上调了AOA-amoA，从而影响固氮和氨氧化作用。Kaziem等（2021）发现，环氧菌酮对映体单体以不同方式影响核心氮循环类群变形菌门（Proteobacteria）、硝化螺菌门（Nitrospirae）和球杆菌门（Gemmatimonadetes），从而调节土壤中的氮代谢。尽管有这些发现，顺式环氧菌酮对映体对农业土壤氮循环的立体选择性效应以及微生物和功能基因的调节机制仍不清楚。为解决这一问题，开展了长期微宇宙培养实验以模拟自然条件下的农业土壤。本研究设置了三个浓度的顺式环氧菌酮，以调查作物残留浓度（0.05 mg/kg）、施用浓度（0.5 mg/kg）和极端施用浓度（5 mg/kg）在不同形式下（(±)-EPO、(+)-EPO、(?)-EPO）的效应差异（Y. Wang等，2026）。本研究利用宏基因组学方法，通过检测微生物群落结构、酶活性和功能基因的相对丰度，系统地调查了顺式环氧菌酮对映体对氮循环的差异性影响。研究结果旨在阐明顺式环氧菌酮在农业土壤中的效应以及微生物的响应策略，为推进土壤氮素肥力研究和促进可持续农业实践提供基础（Peixoto等，2024）。章节摘要化学品外消旋体(±)-顺式环氧菌酮（(±)-EPO，外消旋体纯度>99%）和对映异构体2R,3S-(+)-顺式环氧菌酮（(+)-EPO，对映体纯度>98%）及2S,3R-(?)-顺式环氧菌酮（(?)-EPO，对映体纯度>98%）购自上海凯基Biotech Co., Ltd.（中国上海）。顺式环氧菌酮储备标准品（100 μg/mL，甲醇）购自AccuStandard（康涅狄格州纽黑文）。乙腈、甲苯、乙醇和异丙醇由ANPEL实验室提供。顺式环氧菌酮在农业土壤中的立体选择性耗散农业土壤中顺式环氧菌酮的提取和定量方法显示出高度可靠性，回收率达到101.9 ± 4.3%。(±)-EPO和(?)-EPO在标准溶液中的线性回归数据见表S2。土壤培养实验中顺式环氧菌酮外消旋体和对映体的耗散模式显示出显著的浓度和单体特异性效应。无论浓度如何，(+)-EPO的降解速率均顺式环氧菌酮单omers以不同方式调节微生物群落产生立体选择性降解顺式环氧菌酮的耗散动力学显示，与(?)-EPO相比，(+)-EPO更耐降解，表现出更长的半衰期，并在土壤中构成更大的残留风险。这些发现与先前研究一致，先前研究也报道了(?)-EPO在土壤、河泥和河水中更快的耗散速率（Kaziem等，2020）。(?)-EPO在土壤中的优先耗散，特别是在低浓度下，通过下降的对映体结论本研究通过分析微生物群落、酶活性和功能基因，系统阐明了顺式环氧菌酮对映体对农业土壤氮循环的立体选择性效应。研究结果表明，顺式环氧菌酮对映体单体重组了本地土壤微生物，调节了酶活性，并影响了NFGs的相对丰度，从而对氮循环产生差异性影响。具体而言，(+)-EPO和(±)-EPO处理CRediT作者贡献声明Yaxin Wang：撰写——原稿，可视化，调查，正式分析。Bidan Zhang：验证，调查。Xinyu Song：可视化。Yingying Wang：撰写——审阅与编辑，监督，方法论，资金支持，概念化。Mark Bartlam：撰写——审阅与编辑，资金支持，正式分析，概念化。利益冲突声明作者声明他们没有任何已知的相互冲突的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文报告的工作。致谢本工作得到中国国家自然科学基金（32371706）、广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515011375）、深圳市科技计划（JCYJ20240813114234045）和中国教育部111计划（B17025）的支持。Yaxin Wang|Bidan Zhang|Xinyu Song|Yingying Wang|Mark Bartlam