染料木黄酮靶向 Wnt5a，通过抑制 JNK/JUN 依赖性 MMP9 激活缓解颞下颌关节骨关节炎

《Biochemical Pharmacology》：Genistein targets Wnt5a to alleviate temporomandibular joint osteoarthritis by suppressing JNK/JUN-dependent MMP9 activation

　　

摘要

颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）是一种进行性退行性关节疾病，其特征为软骨破坏、细胞外基质（ECM）降解和慢性炎症，然而目前有效的疾病修正型治疗靶点和药物干预手段仍然有限。本研究采用单月桂酸钠（MIA）诱导的大鼠TMJ-OA模型和白细胞介素-1β（IL-1β）刺激软骨细胞，整合转录组学分析、染色质可及性谱分析和分子筛选，以阐明疾病机制并鉴定候选化合物。整合RNA测序（RNA-seq）分析发现Wnt家族成员5a（Wnt5a）是与TMJ-OA进展显著相关的关键上游调控因子，而利用转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）揭示了以激活蛋白-1（AP-1）活性增强和JUN依赖性Mmp9转录调控为特征的炎症性染色质景观。机制上，Wnt5a激活c-Jun N-末端激酶（JNK）信号通路，促进JUN核内积累并增强AP-1介导的Mmp9转录，导致ECM降解和软骨细胞功能障碍。基于结构的虚拟筛选和生物物理检测，包括表面等离子共振（SPR）、细胞热迁移试验（CETSA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS），鉴定出染料木黄酮（GEN）为能够直接结合Wnt5a的小分子化合物，并具有细胞靶标结合证据支持。功能上，染料木黄酮抑制Wnt5a/JNK/JUN/MMP9信号轴，部分恢复II型胶原（COL2A1）表达，减轻氧化应激，并在TMJ-OA大鼠中保护软骨完整性。综上所述，本研究确立了Wnt5a作为TMJ-OA进展的可治疗驱动因子，并鉴定染料木黄酮为具有软骨保护活性的Wnt5a靶向化合物，为退行性关节疾病的疾病修正型干预措施开发提供了基于机制的循证依据。

引言

TMJ-OA是一种进行性退行性关节疾病，其特征为软骨降解、软骨下骨改变和持续性疼痛。它损害咀嚼功能并显著降低生活质量[1]，[2]，[3]。鉴于颞下颌关节（TMJ）作为颌面区高活动性滑膜关节的性质，其特别容易受到机械应力和炎症损伤的影响。然而，目前临床干预手段（包括非甾体抗炎药、物理治疗和咬合夹板）在很大程度上仍处于对症治疗水平，无法阻止或逆转进行性软骨退变[4]，[5]。因此，鉴定驱动TMJ-OA进展且具有治疗潜力的分子靶点对于推进疾病修正型治疗策略至关重要。

近期研究已确立炎症关节微环境是软骨细胞代谢功能障碍和进行性软骨基质破坏的关键驱动因素[6]，[7]，[8]。单细胞转录组学和滑液代谢组学研究进一步揭示了TMJ-OA中广泛的细胞间通讯和疾病相关的代谢改变[9]，[10]。炎症细胞因子，特别是IL-1β，刺激基质降解酶的产生，包括基质金属蛋白酶（MMPs），从而促进COL2A1降解和软骨完整性丧失[11]，[12]，[13]。在这些酶中，MMP9已被确认为骨关节炎软骨分解代谢的关键介质[14]。然而，MMP9表达的上游调控机制仍不明确，限制了我们开发精准治疗干预策略的能力。

越来越多的证据表明，Wnt信号通路在维持组织稳态的同时，参与炎症条件下的病理性重塑，并逐渐被证实与骨关节炎进展相关[15]，[16]。虽然经典Wnt/β-catenin信号通路已被充分阐明，但累积证据表明非经典Wnt通路也能促进骨关节炎组织的炎症和重塑。特别是，细胞外配体Wnt5a在骨关节炎软骨中常高表达，与炎症反应、基质降解和组织重塑密切相关[17]。作为细胞外信号分子，Wnt5a代表了潜在的可药靶治疗靶点。Wnt5a可激活下游激酶级联反应，包括JNK信号通路。这些信号级联最终汇聚到AP-1转录因子，特别是JUN，以调控ECM相关基因的表达[8]，[18]，[19]。然而，TMJ-OA进展中Mmp9转录激活的关键上游调控因子仍未被完全阐明，限制了疾病修正型治疗的开发[20]。

小分子药物和源自天然产物的生物活性化合物已显现为骨关节炎干预的有前景的候选者。它们能够调节炎症并维持软骨稳态[21]，[22]，[23]，[24]，[25]，[26]。染料木黄酮是一种天然存在的异黄酮，能抑制炎症介质的产生，并在实验性骨关节炎模型中发挥软骨保护作用[27]，[28]。早期研究表明，染料木黄酮作为NF-κB、MAPK及相关炎症信号通路的调节因子[29]，[30]，[31]，[32]。然而，染料木黄酮是否能直接靶向特定分子成分及其治疗效果的精确分子机制仍大部分未被阐明，特别是其在TMJ-OA中的作用机制。

本研究采用整合多组学和药理学策略，鉴定TMJ-OA的治疗靶点并制定基于机制的干预策略。我们发现Wnt5a是与炎症性软骨分解代谢相关的上游调控因子，并进一步阐明了促进AP-1依赖性Mmp9转录的Wnt5a/JNK/JUN信号级联。此外，通过基于结构的筛选和生物物理验证，我们证实染料木黄酮能够直接与Wnt5a相互作用，可作为靶向Wnt5a的小分子化合物。功能研究和体内实验进一步表明，用染料木黄酮靶向Wnt5a能够抑制TMJ-OA模型中的软骨退变并改善关节结构完整性。总之，本研究确立了Wnt5a作为具有药物开发潜力的治疗靶点，并为退行性关节疾病中Wnt5a定向干预策略的开发提供了基于机制的循证依据。

章节摘要

试剂、抗体和引物

重组小鼠Wnt5a蛋白（货号 HY-P704313）、Wnt5a特异性拮抗剂Box5（CAS：1206604–29-6，货号 HY-123071）、染料木黄酮（CAS：446–72-0，货号 HY-14596）、JNK特异性抑制剂SP600125（CAS：129–56-6，货号 HY-12041）和Fer-1（CAS：347174–05-4，货号 HY-100579）均购自MedChemExpress（MCE，美国新泽西州）。为确保实验一致性，验证染料木黄酮纯度为99.82%，作为化学定义明确的

整合转录组学谱分析鉴定Wnt5a为TMJ-OA中软骨分解代谢的上游调控因子

为鉴定TMJ-OA进展中可治疗性分子驱动因子，我们采用了整合体内和体外转录组学筛选策略（图1A）。在分离和鉴定原代大鼠下颌骨髁突软骨细胞（MCCs）后，我们通过MIA灌注射建立体内大鼠TMJ-OA模型，并通过IL-1β刺激建立体外炎症MCCs模型。火山图可视化了病理状态下的转录组改变

讨论

TMJ-OA涉及渐进性软骨丢失、软骨下骨异常重塑和持续性炎症反应，这些因素共同损害关节功能并负面影响患者健康状况[3]，[5]。尽管其发病率较高，但现有治疗方法大多仍处于对症治疗水平[4]。因此，鉴定驱动TMJ-OA进展且具有治疗潜力的分子靶点是重要且未被满足的临床需求。为客观

CRediT作者贡献声明

Mengyuan Ji：撰写 – 初稿，调查研究。Xinyu Wang：方法学，数据整理。Wentao Zhang：调查研究，形式分析。Zihui Xie：验证。Xu Zhu：软件。Hao Xue：验证。Zhao Ding：方法学。Yanxun Han：形式分析。Dapeng Li：资源，获取经费。Liang Ge：可视化。Zhongdong Hu：撰写 – 审阅与编辑。Xiaojun Zha：撰写 – 审阅与编辑，资源，获取经费，概念化。Wei Lin：指导，获取经费，

伦理审批和同意参与

所有动物实验均经安徽医科大学实验动物伦理委员会审查并批准（批准号 LLSC20252094）。所有涉及动物的操作和动物护理均按照动物福利的国家立法、实验室动物饲养和使用相关指南以及动物研究：In Vivo实验报告指南进行。

资金来源

本工作由国家自然科学基金委员会（82371133）、安徽省高等学校自然科学研究基金（2024AH050730）、安徽省教育厅项目（2024AH040112）、安徽医科大学2020年基础与临床合作研究促进计划（2020xkjT014）、授予X. Zha的横向研究项目（H2024034和H2025058）以及2025年安徽省卫生健康科技计划项目（AHWJ2025Ab30131）资助

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文所报告的工作。

Mengyuan Ji|Xinyu Wang|Wentao Zhang|Zihui Xie|Xu Zhu|Hao Xue|Zhao Ding|Yanxun Han|Dapeng Li|Liang Ge|Zhongdong Hu|Xiaojun Zha|Wei Lin