《Journal of Pain Research》：Acupotomy Alleviates Pain and Attenuates Spinal Neuronal Hyperexcitability in Knee Osteoarthritis Rats: Implication of the CaMKII/GluA1 Axis
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目的：探讨针刀疗法对碘乙酸钠（MIA）诱导的膝骨关节炎（KOA）大鼠慢性疼痛及中枢敏化的脊髓水平镇痛机制。
方法：在MIA诱导KOA并经三周针刀干预后的大鼠中，评估其疼痛行为及关节病理变化。采用脊髓RNA测序（RNA-sequencing）筛选差异表达基因。通
目的：探讨针刀疗法对碘乙酸钠（MIA）诱导的膝骨关节炎（KOA）大鼠慢性疼痛及中枢敏化的脊髓水平镇痛机制。
方法：在MIA诱导KOA并经三周针刀干预后的大鼠中，评估其疼痛行为及关节病理变化。采用脊髓RNA测序（RNA-sequencing）筛选差异表达基因。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）在mRNA和蛋白水平验证关键靶点（CaMKII和GluA1）。此外，利用免疫荧光和全细胞膜片钳电生理技术评估脊髓胶状质（SG）神经元的激活状态与兴奋性。
结果：针刀疗法显著减轻了KOA大鼠的机械性和热痛觉过敏，并减缓了关节退变。RNA-seq分析揭示脊髓中220个基因的表达受到调控。这些差异表达基因（DEGs）显著富集于钙信号传导和突触传递通路，提示CaMKII和Gria1为潜在的关键分子。分子验证证实，针刀疗法下调了CaMKII和Gria1的mRNA表达以及CaMKII和GluA1的磷酸化比率。此外，针刀疗法减少了脊髓SG区域p-CaMKII阳性神经元的激活，并抑制了其异常高频的动作电位放电。
结论：针刀干预可改善KOA的外周关节退变并发挥显著的镇痛作用，同时伴随脊髓SG神经元内在高兴奋性的降低。尽管仍需利用靶向抑制剂进行直接的因果验证，但本研究结果表明，这种镇痛效应与CaMKII/GluA1信号轴的下调密切相关，这为其提供了一个合理的中枢机制框架。
一、研究背景与科学问题
膝骨关节炎（KOA）是一种以关节软骨进行性破坏、软骨下骨硬化或囊变、滑膜炎症及关节周围肌肉萎缩为特征的退行性疾病，其核心临床表现为顽固性慢性疼痛和严重功能障碍。作为全球肌肉骨骼疼痛的主要病因之一，KOA不仅严重影响患者生活质量，还导致巨大的生产力损失和医疗成本上升。目前，非甾体抗炎药和阿片类药物是标准药物治疗方案，但长期使用受限于胃肠道、心血管和肾脏毒性等全身性不良反应。晚期KOA患者常因严重软骨破坏和难以忍受的疼痛而需接受全关节置换术。因此，探索安全、有效且能提供持久镇痛的靶向干预策略仍是KOA管理中亟待满足的临床需求。
KOA相关疼痛的临床表现随病程动态演变。早期通常表现为间歇性、活动诱发的锐痛，晚期则逐渐转变为自发性、持续性钝痛和痛觉过敏。伤害性信号的传递始于外周伤害感受器对病理刺激的换能，神经冲动沿初级传入纤维抵达脊髓背角进行初步整合，随后投射至脑干、大脑皮层和边缘系统，最终产生痛觉感知。新证据表明，来自外周的持续异常伤害性输入可诱发并维持“中枢敏化”，即中枢神经系统伤害性神经元对其正常或阈下传入输入的响应放大。中枢敏化与外周伤害性、炎症性、神经病理性及心理因素共同作用，被认为是KOA难治性慢性疼痛的关键成因。脊髓背角作为外周伤害性信号进入中枢神经系统的首要中继和整合中心，在此过程中扮演核心角色。大量研究表明，在慢性KOA疼痛模型中，脊髓背角表现出深刻的突触可塑性和突触传递效能改变，并伴有特定的异常基因表达谱。因此，将机制焦点从外周关节病理转向脊髓中枢敏化，为阐明KOA慢性疼痛的复杂发病机制提供了重要途径。
针刀疗法是一种利用微型手术刀松解病理组织、旨在解除机械压迫并恢复关节生物力学的微创干预手段。尽管针刀被广泛用于KOA治疗，但现有临床证据受限于方法学缺陷，如依赖主观指标、分配隐藏不充分、样本量小以及缺乏标准化假手术对照。因此，针刀被认为是一种有待进一步生物学验证的治疗选择。然而，现有的机制研究主要局限于外周软组织修复和局部炎症调节。关于其中枢机制的认知匮乏，凸显了开展临床前研究以弥合临床观察与潜在分子原理之间差距的必要性。
尽管脊髓中枢敏化在KOA疼痛中的作用已被公认，但针刀镇痛效应的精确分子机制在很大程度上仍未被探索。虽然已知突触可塑性和谷氨酸能神经传递是中枢敏化的广泛促成因素，但针刀所调控的具体转录组改变和分子轴尚不完全清楚。为解决这一空白并避免先入为主的机制假设，研究人员采用了无偏倚的RNA-seq技术，筛选针刀干预后KOA大鼠脊髓中的差异表达基因。在这些转录组学发现的指导下，研究人员随后聚焦于CaMKII/GluA1信号通路。通过分子验证和全细胞膜片钳电生理学，旨在探究该特定通路的调控是否有助于降低SG神经元的固有兴奋性，从而为针刀诱导的镇痛提供一个潜在的生物学依据。
二、主要研究方法
- 1.
动物模型与分组：采用成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，随机分为假手术组、KOA模型组和针刀干预组。KOA模型通过右膝关节腔内注射碘乙酸钠（MIA）建立，假手术组注射等量生理盐水。
- 2.
行为学与组织学评估：通过测量膝关节横径评估肿胀程度；使用热板实验测定缩足潜伏期（PWL）评估热痛觉过敏；使用电子von Frey测痛仪测定机械缩足阈值（MWT）评估机械性痛觉过敏。通过苏木精-伊红（H&E）染色和改良Mankin评分评估膝关节软骨退变程度。
- 3.
转录组学分析：提取各组大鼠腰膨大脊髓组织总RNA进行RNA测序（RNA-seq），筛选差异表达基因（DEGs），并进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。
- 4.
分子生物学验证：采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测CaMKII和Gria1的mRNA表达水平；采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测p-CaMKII和p-GluA1的蛋白磷酸化水平。
- 5.
组织化学与电生理学：通过双重免疫荧光染色检测脊髓胶状质（SG）区p-CaMKII阳性神经元中c-Fos的共表达情况。运用离体脊髓切片全细胞膜片钳技术，在电流钳模式下记录SG神经元在不同去极化电流刺激下的动作电位（AP）发放频率，评估其固有兴奋性。
三、研究结果
1. 针刀疗法缓解KOA大鼠疼痛样行为并改善膝关节组织病理学
与假手术组相比，KOA大鼠膝关节横径显著增大，机械缩足阈值和热缩足潜伏期显著降低。针刀干预在第28至35天显著减小了膝关节直径，并在第21至35天显著逆转了MWT和PWL的下降。H&E染色显示，KOA组出现严重的软骨侵蚀、大量软骨细胞丢失和结构紊乱，而针刀干预明显减轻了这些退行性改变。定量分析证实，针刀干预显著降低了升高的Mankin评分，改善了组织病理学关节损伤。
2. 脊髓转录组学分析：鉴定针刀镇痛的关键信号通路
RNA-seq分析发现，KOA组与假手术组之间有1060个DEGs，针刀组与KOA组之间有397个DEGs。韦恩图分析确定了220个反向调控的DEGs作为针刀的核心靶点。层级聚类显示针刀显著逆转了KOA诱导的转录变化。GO分析表明这些核心DEGs主要富集于神经系统功能和信号转导。KEGG分析显示其在钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、以及谷氨酸能突触等通路显著富集。转录组数据提示，CaMKII和Gria1（GluA1）在KOA大鼠中显著上调，而针刀使其下调。RT-qPCR验证证实，KOA组脊髓中CaMKII和Gria1的mRNA表达水平显著高于假手术组，而针刀组则显著低于KOA组。
3. 针刀与脊髓中CaMKII和GluA1磷酸化水平降低相关
Western blotting结果显示，与假手术组相比，KOA组大鼠脊髓中p-CaMKII/CaMKII和p-GluA1/GluA1的比值均显著升高。相反，针刀处理显著抑制了这些升高的磷酸化比率。
4. 针刀减少KOA大鼠脊髓背角p-CaMKII阳性神经元的异常激活
免疫荧光染色显示，与假手术组相比，KOA大鼠脊髓背角SG区p-CaMKII阳性神经元中c-Fos的共表达率显著增加，反映了病理性神经元激活。针刀干预有效地逆转了这一增加，使共表达率相对于KOA组显著降低。
5. 针刀降低脊髓SG区域神经元的兴奋性
全细胞膜片钳记录显示，在所有组中，动作电位（AP）发放频率均随去极化电流增加而升高。在较高去极化电流（120–200 pA）下，KOA组的AP频率显著高于假手术组。而针刀干预组在这些高电流步骤下的AP发放频率相较于KOA组显著降低。这表明针刀干预有效抑制了KOA诱导的SG神经元在强刺激下异常升高的固有兴奋性。
四、讨论总结与研究结论
讨论总结：
本研究结合转录组学、分子验证、免疫荧光和电生理记录，在MIA诱导的KOA大鼠模型中描述了针刀的脊髓效应。针刀减少了疼痛相关行为并减弱了伤害性神经元高兴奋性的多个标志物——这些发现共同指向中枢敏化的减轻，其中可能涉及脊髓CaMKII/GluA1信号轴的贡献。研究指出，KOA是一种多因素慢性退行性疾病，中枢敏化是其疼痛慢性化和空间扩散的关键机制。MIA模型能很好地模拟人类KOA的病理进展。针刀的局部治疗效果已有报道，但其是否涉及脊髓水平的伤害性处理变化此前尚不清楚。RNA-seq发现针刀逆转了KOA诱导的220个基因表达变化，这些基因富集于钙信号和突触传递通路，进而锁定CaMKII和Gria1。后续验证确认针刀在转录水平抑制了该信号轴的上调。研究进一步探讨了CaMKII磷酸化激活GluA1增强AMPA受体功能的机制，针刀降低了脊髓中p-CaMKII和p-GluA1的水平，与这一通路相符，但未直接测量AMPA受体表面表达或突触电流，也未进行功能缺失实验，因此两者间的联系仅为假设。针对SG区域的检测显示，针刀减少了该区域p-CaMKII阳性神经元中c-Fos的共表达，电生理记录也证实针刀抑制了SG神经元的高频放电。研究承认了多项局限性：包括因果关系验证不完整（需特异性抑制剂或病毒敲降）；各项指标仅反映伤害性处理的某一方面；针刀对外周病理的改善可能导致脊髓激活的降低是继发性的，而非直接的中枢神经调节作用；缺乏假针刀对照组；仅使用雄性大鼠限制普适性；以及短期临床前发现转化为持久临床效益需谨慎。
研究结论：
综上所述，这些发现表明，针刀能够减少KOA大鼠的疼痛相关行为并减弱脊髓SG区域伤害性神经元高兴奋性的标志物，这些结果与中枢敏化的减轻相一致，但尚不足以完全确立这一点。脊髓CaMKII/GluA1轴的下调为这些变化提供了一个合理的分子相关性，但从CaMKII激活到AMPA介导的传递再到动作电位放电的假定因果序列仍需直接验证，并且当前的研究设计无法区分这是直接的中枢效应还是继发于外周输入减少的效应。因此，本研究为针刀在KOA中的中枢效应提供了一个关联性框架，而非一个已被证实的因果机制。
