《Journal of Chromatographic Science》：Glycopyrronium bromide, formoterol fumarate dihydrate and their related compounds with UPLC/PDA-MS for simultaneous determination in pressurized metered-dose inhaler product
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已开发并验证了一种采用光电二极管阵列-质谱（PDA-MS）检测器的超高效液相色谱（UPLC）技术，用于测定压力定量吸入剂（pMDI）中格隆溴铵（GB）、富马酸福莫特罗二水合物（FFD）及其相关物质。这是该方法首次被实施。色谱分析在配备单四极杆质谱仪（QDa）和
已开发并验证了一种采用光电二极管阵列-质谱（PDA-MS）检测器的超高效液相色谱（UPLC）技术，用于测定压力定量吸入剂（pMDI）中格隆溴铵（GB）、富马酸福莫特罗二水合物（FFD）及其相关物质。这是该方法首次被实施。色谱分析在配备单四极杆质谱仪（QDa）和PDA检测器的UPLC系统上进行。在进样阀前使用了C18色谱柱，柱温设定为40°C。每次分析进样1 μL，流速为0.1 mL/分钟。所用流动相为A（含0.5%甲酸的甲醇溶液）和B（含0.5%甲酸的水溶液），方法总运行时间为30分钟。PDA检测器在215 nm波长下工作，质谱检测器设置为提取离子色谱（XIC）模式。GB杂质的检测限（LOD）范围为0.28至0.30 ng/mL，定量限（LOQ）范围为0.92至1.01 ng/mL。GB和FFD表现出线性准确性。研究人员研究了在相应杂质定量限值至定量限值400%范围内相关物质的准确性。该方法具有线性、快速、可重复且准确的特点。所提出的方法快速、线性、准确且可重现。采用QDa结合XIC模式的UPLC-MS方法被开发用于测定GB和FFD的相关物质及含量。
论文解读
研究背景与目的
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一类以慢性、复发性气流受限为特征的严重肺部疾病群，主要症状包括呼吸困难、咳嗽和咳痰，其类型涵盖慢性支气管炎、支气管扩张、肺气肿和支气管哮喘。烟草及烟草制品的使用是该病的主要诱因，此外遗传因素、发展中国家因烹饪和取暖产生的通风不良烟雾污染等也是致病原因。格隆溴铵（GB）是一种长效抗毒蕈碱药物，通过抑制气道中的M3受体引起平滑肌支气管扩张，其作用持续时间超过12小时；富马酸福莫特罗二水合物（FFD）则是一种长效选择性β2-肾上腺素能受体激动剂，起效迅速（1-3分钟内）且作用持久，吸入后12小时仍有效。市场上含有GB和FFD的知名复方药物为Bevespi Aerosphere?。
在压力定量吸入剂（pMDI）产品中同时含有多种活性成分，每种活性成分都可能产生大量杂质，增加了制剂基质中的辅料种类，这给分析带来了挑战。因此，使用单一、可靠的方法同时定量分析药物产品中的活性成分及其相关杂质至关重要。文献中已有多种HPLC方法结合电化学、紫外（UV）和库仑检测器用于测定GB或FFD，但已发表的反相超高效液相色谱（RP-UPLC）方法相比，本研究在单次进样的运行时间上具有10分钟的优势，并且能够检测23种更低浓度的杂质，这是以往任何方法都不具备的能力。目前尚无UPLC-QDa方法同时监测GB、FFD及其杂质。本研究旨在开发一种更快、更灵敏、更准确的UPLC-QDa方法，用于药物中GB、FFD及其相应杂质的定量分析。
主要关键技术方法
研究人员开发并验证了一种UPLC-PDA-MS方法。色谱分离采用Waters Acquity UPLC系统，配备Acquity BEH C18色谱柱（100 × 2.1 mm，粒径1.7 μm），柱温40°C，进样量1 μL，流速0.1 mL/分钟。流动相A为含0.5%甲酸的甲醇溶液，流动相B为含0.5%甲酸的水溶液，采用梯度洗脱程序，总运行时间30分钟。检测采用PDA检测器（215 nm）和配备电喷雾电离（ESI）源的QDa质谱检测器，在提取离子色谱（XIC）模式下运行，驻留时间50-100 ms。样品制备涉及将pMDI罐体置于液氮中冷却后切割，用溶剂混合物洗涤。标准溶液和样品溶液使用0.5%甲酸水溶液、乙腈和甲醇按65:20:15（v/v/v）比例的混合溶剂配制。方法验证按照国际协调会议（ICH）指南进行，包括专属性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、准确性、线性、精密度和溶液稳定性。
研究结果
方法开发：研究人员开发了一种新的准确精密方法，可同时测定GB、FFD及其21种杂质，这是首次在pMDI药品中实现两种活性成分和21种杂质的同步检测。通过评估多种色谱柱，最终确定Acquity BEH C18柱能提供最有效的分离模式。由于FFD杂质C、D和E具有相同的质荷比（m/z），研究重点是实现色谱分离。采用0.5%甲酸水溶液和0.5%甲酸甲醇溶液作为流动相，通过梯度程序在30分钟内完成了23种不同物质的联合检测。
专属性：通过注射空白溶液、标准溶液、样品溶液以及单独加标至相应限度浓度的杂质溶液来评估专属性。在两种活性成分的保留时间（RT）处未观察到来自环境基质（杂质、安慰剂和溶剂）的干扰，证明了方法的专属性。通过QDa检测器在目标m/z值处使用XIC监测分析物，进一步增强了选择性。
线性、LOD和LOQ：在三个浓度水平建立校准曲线以确认含量测定和杂质定量的线性。GB的线性浓度范围为900-3600 ng/mL，各杂质的线性范围约为45.9-2010 ng/mL。所有回归系数的R2值均≥0.995。LOD以信噪比至少3:1确定，LOQ以信噪比至少10:1确定。GB杂质的LOD范围为0.43-5.36 ng/mL，LOQ范围为1.85-14.9 ng/mL。
准确性和精密度：活性成分的准确性通过分析目标浓度50%、100%和200%的三份样品确定，回收率在98.0-102.0%的可接受范围内。杂质测量的准确性通过分析LOQ、100%和400%目标浓度的三份重复样品确定，回收率在70.0-130.0%（LOQ水平）和80.0-120.0%（100%和400%水平）的可接受范围内。活性物质测定的相对标准偏差（RSD%）不超过2.0%，各化合物峰面积之间的RSD%低于10.0%。
溶液稳定性：在5°C自动进样器中于预定时间点注入制备的样品和标准溶液，以确定溶液在规定范围内保持不变的时长。
实际样品分析：对三个批次（批号6030052A00、6030011A00和6030007A00）的Bevespi Aerosphere? 9/4.8 mcg/喷产品进行了评估。三个批次的GB/FFD含量测定结果分别为99.5/97.3%、100.1/98.9%和101.2/100.1%。三个批次中均未检出GB杂质。FFD杂质A为0.1%，杂质D低于LOQ，杂质B、C、E、G、H和I未检出。
讨论与结论
讨论部分强调了色谱柱选择在优化色谱条件中的关键作用。研究通过比较Acquity BEH C18、Acquity HSS PFP和Acquity BEH C8色谱柱，最终确定BEH C18柱能提供最有效的分离模式。由于FFD杂质C、D和E具有相同的m/z比，色谱分离成为必要目标。研究选择了易于制备、促进电离且不在质谱检测器中残留的流动相，并通过梯度程序缩短了运行时间。该方法相比已发表的反相UPLC方法，在单次进样的运行时间上具有10分钟的优势，且能检测23种更低浓度的杂质，这是前所未有的能力。
研究结论部分指出，该UPLC-MS方法利用QDa结合XIC模式，成功开发并验证了用于测定GB和FFD相关物质及含量的方法。该方法快速、线性、准确且可重现，能够同时分析活性药物及其杂质，实现了时间的高效利用，这在制药行业至关重要。该方法在灵敏度、选择性和效率方面表现出改进的性能，且因较低的流动相流速和有机相比例而具有环境友好优势。
