《Clinica Chimica Acta》：A novel dual-epitope ELISA reveals heterogeneity of circulating lipoprotein lipase: distinguishing intact LPL from total LPL
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•一种新颖的双表位ELISA可定量检测结构完整的循环LPL。•该检测方法可将完整LPL与总免疫反应性LPL区分开来。•循环LPL由结构异质性的分子种类组成。•完整LPL和总LPL在代谢条件下表现出不同的模式。•完整LPL可能提供总LPL测量无法捕获的信息。引言脂蛋白脂肪酶（L
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一种新颖的双表位ELISA可定量检测结构完整的循环LPL。
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该检测方法可将完整LPL与总免疫反应性LPL区分开来。
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循环LPL由结构异质性的分子种类组成。
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完整LPL和总LPL在代谢条件下表现出不同的模式。
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完整LPL可能提供总LPL测量无法捕获的信息。
引言
脂蛋白脂肪酶（LPL）是水解循环乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）中甘油三酯的主要酶[1]、[2]。LPL在脂肪细胞和肌细胞中合成，并通过糖基磷脂酰肌醇锚定的高密度脂蛋白结合蛋白1（GPIHBP1）转运至毛细血管腔，在那里介导血管内脂解[3]、[4]、[5]。循环LPL传统上通过酶活测定和免疫学检测进行评估，特别是在肝素处理后血浆中[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。然而，常规ELISA可能检测到多种LPL免疫反应性分子种类，并不能直接确立完整的分子完整性、天然构象或酶活性。事实上，循环LPL具有结构异质性，并且经常与富含甘油三酯的脂蛋白结合[8]、[9]、[10]、[11]。虽然LPL历史上被认为以同源二聚体形式发挥活性[7]、[12]、[13]，但结构和生化研究表明，与GPIHBP1结合的单体LPL可以具有催化活性[14]、[15]、[16]、[17]。
LPL的结构和活性受到动态调控。GPIHBP1稳定LPL的催化结构域，而血管生成素样蛋白可以促进LPL失活和构象不稳定[16]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。ANGPTL4可以促进LPL展开并促进胞内切割，而ANGPTL3/8复合物抑制血管内LPL并可以诱导催化结构域的展开[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。重要的是，催化活性的丧失并不一定需要蛋白水解切割或末端表位的丧失[13]、[16]、[20]、[22]、[23]。
尽管长期以来已认识到大部分肝素处理前的循环LPL是无催化活性的[8]、[9]，但该免疫反应性池的分子组成仍不明确。由于LPL在血管内皮表面发挥其脂解活性，循环LPL的分子形式相对较少受到研究关注。据我们所知，此前尚未报道过任何公认的免疫学方法能够基于抗体定义的N端和C端区域的同时识别来选择性定量循环LPL种类。
因此，我们开发了一种双表位夹心ELISA，使用新开发的针对LPL极端N端和C端区域的抗体。出于本研究的目的，同时被两种抗体定义的表位识别的LPL种类在操作术语上被指定为"完整LPL"。这种检测定义的指定本身并不能确立完整的分子完整性、天然构象或酶活性。我们表征了该检测的分析特性和生化性质，并在空腹和餐后血浆、MCS[26]、[27]以及GPIHBP1自身抗体综合征[28]、[29]中检测了完整LPL。
章节摘要
研究受试者
来自19名年轻志愿者（10名男性和9名女性；中位年龄24岁；平均BMI 27 kg/m2）的血浆样本，来自加州大学戴维斯分校先前描述的一项关于糖摄入代谢影响的研究[30]。参与者接受静脉注射肝素（50 U/kg）。分别在上午8:00和晚上8:00采集空腹和餐后样本。该研究经加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准，所有参与者均提供了书面
表位定位与检测设计
F1A识别人LPL的第3-8个氨基酸残基（Beigneux A，个人通讯），位于催化残基Ser132、Asp156和His241之外。R23B和88B8识别不同的C端表位。基于使用F1A与任一C端抗体的ELISA系统之间的强相关性，选择R23B用于完整LPL ELISA，选择88B8用于免疫印迹分析。因此，完整LPL检测以F1A作为捕获抗体，以R23B作为检测抗体构建（
讨论
我们开发了一种双表位ELISA，能够识别循环免疫反应性LPL异质性池中的一个检测定义的亚群。常规LPL免疫测定定量总免疫反应性LPL质量[6]、[10]、[11]、[37]，但不能基于抗体定义的N端和C端区域的同时识别来区分种类。通过要求同时识别极端N端F1A表位和C端R23B表位，本检测提供了生化
CRediT作者贡献声明
长泽拓海：调查、正式分析、数据整理。中岛克行：撰写——初稿、方法学、调查、概念化。白河崇：调查、正式分析、数据整理。宫下和也：正式分析、数据整理。深町勇：正式分析、数据整理。田中明：撰写——审阅与编辑、调查、资金获取、概念化。王建：正式分析、数据整理。亚当·D·麦金泰尔：正式分析，
伦理审批
本研究方案经加州大学戴维斯分校（美国加利福尼亚州戴维斯市）、西安大略大学（加拿大安大略省伦敦市）和群馬大学（日本前桥市）的机构审查委员会批准，以及其他参与机构的伦理委员会批准。所有参与者均获得了书面知情同意。伦理审批和研究程序的详细信息见"材料与方法"部分。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）进行英文语言编辑。作者已审阅和编辑输出内容，并对文章内容承担全部责任。
资金支持
本工作由日本学术振兴会（JSPS）科研基金（项目编号22H02965和25K10703，资助M.M.）支持。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系，这些关系可能被视为潜在的利益冲突：R.A.H.报告称从Akcea/Ionis、Amgen、Arrowhead、HLS Therapeutics、Medison、Novartis、Pfizer、Regeneron、Sanofi和Ultragenyx获得咨询费。其他作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本稿件中报告的工作。
致谢
作者衷心感谢金博尔·L·斯坦霍普博士和彼得·J·哈维尔博士（美国加利福尼亚州戴维斯市加州大学戴维斯分校）的长期合作以及对餐后脂蛋白研究的贡献。作者还感谢史蒂芬·G·杨博士和安妮·P·贝尼奥博士（美国加利福尼亚州洛杉矶市加州大学洛杉矶分校）以及迈克尔·普卢格博士（丹麦哥本哈根芬森实验室，皇家医院）关于GPIHBP1-LPL相互作用的有价值讨论。
长泽拓海|中岛克行|白河崇|宫下和也|深町勇|田中明|王建|亚当·D·麦金泰尔|罗伯特·A·黑格尔|中岛清美|棚川克彦|村上正美
