哺乳动物细胞中DNA甲基化的位点特异性重写：表观基因组编辑技术的进展与应用

《Current Opinion in Chemical Biology》：Locus-specific rewriting of DNA methylation in mammalian cells

基础DNA甲基化生物学知识为表观基因组编辑器（epigenome editors）的设计提供了理论指导。可编程的DNA甲基化编辑器通过靶向甲基化与去甲基化，实现基因的抑制与激活。基于DNA甲基化的表观基因组编辑在基础生物学与转化生物学研究中具有广泛应用价值。

DNA甲基化是哺乳动物细胞中最丰富的表观遗传修饰，参与转座子沉默、发育和组织特异性基因表达调控、基因组印记以及X染色体失活等关键过程。DNA甲基化模式在发育和分化中高度动态，需要写入、擦除和维持机制的协同。其失调与癌症、神经系统疾病和衰老密切相关。传统药物或遗传扰动常导致全基因组范围的甲基化改变，难以解析特定基因座的功能。因此，开发位点特异性DNA甲基化重写工具对基础研究和治疗应用至关重要。近年来，锌指蛋白（zinc finger protein, ZFP）、转录激活因子样效应物（transcription activator-like effector, TALE）和RNA引导的CRISPR-Cas系统等可编程DNA结合平台，与DNA甲基化写入因子或擦除因子融合，实现了位点特异性的DNA甲基化重写。

该综述系统回顾了DNA甲基化生物学原理如何指导表观基因组编辑器设计，总结了位点特异性DNA甲基化编辑技术的发展、治疗应用、基础研究应用及脱靶效应评估。研究人员指出，利用内源性DNA甲基化调控机制，表观基因组编辑器能够建立持久且可遗传的转录抑制或激活，并已进入临床转化阶段。

所综述的关键技术包括：基于DNMT3A/3B和DNMT1的甲基化写入工具，基于TET双加氧酶的去甲基化工具，以及ZFP、TALE、dCas9等靶向平台。编辑器设计经历了从催化结构域直接融合到机理引导的复杂工程化发展，包括将KRAB、DNMT3A和DNMT3L融合到单一dCas9构建体中的CRISPRoff，以及无酶编辑器CHARM（Coupled Histone tail for Autoinhibition Release of Methyltransferase），后者通过融合组蛋白H3尾部和非催化性DNMT3L结构域，招募内源DNMT3A。去甲基化方面，TET1催化域与TALE或CRISPR融合可诱导靶位点去甲基化和基因激活。相关研究使用了小鼠肝脏模型、非人灵长类模型、人源细胞系以及已进入临床试验的候选疗法（如NCT06671093、NCT07200193、NCT06907875、NCT07428473）。

DNA甲基化写入与擦除（DNA methylation writers and erasers）。研究人员总结了DNA甲基化写入依赖从头甲基转移酶DNMT3A/3B和维持甲基转移酶DNMT1。DNMT3L虽无催化活性，但可结合DNMT3A/3B并刺激其活性；结构研究显示DNMT3A与DNMT3L形成异源四聚体复合物（DNMT3L-DNMT3A-DNMT3A-DNMT3L），其催化结构域沿DNA螺旋排列，以约10 bp间隔甲基化CpG位点。去甲基化可通过DNMT1维持失败导致的被动途径，或由TET双加氧酶介导的主动途径完成。TET酶将5^mC氧化为5^hmC、5^fC和5^caC，后者被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（thymine-DNA glycosylase, TDG）和碱基切除修复途径识别，最终恢复未修饰胞嘧啶。但TET酶如何靶向特定基因组位点仍不清楚。

DNA甲基化与染色质水平串扰（DNA methylation and chromatin-level crosstalk）。DNMT3A的ADD结构域优先识别不含H3K4甲基化的组蛋白H3尾部（H3K4me0），PWWP结构域识别H3K36甲基化，从而使DNA甲基化与组蛋白修饰状态耦合。DNA甲基化还与H3K9甲基化等抑制性修饰共定位，共同建立异染色质。这些观察表明DNA甲基化与染色质环境紧密整合，但特定区域获得甲基化的机制仍缺乏完整理解。

位点特异性DNA甲基化编辑技术（Technologies for locus-specific editing of DNA methylation）。1997年Xu和Bestor将细菌甲基转移酶M.SssI与ZFP融合，首次实现可编程DNA甲基化。2016年Amabile等发现共定位DNMT3A、DNMT3L和KRAB可增强沉默，并能通过细胞分裂维持，形成“打了就跑”（hit-and-run）的表观遗传编辑。CRISPRoff将KRAB、DNMT3A和DNMT3L融合到dCas9，可在启动子和增强子处实现持久沉默。CHARM则无外源甲基转移酶，通过H3尾部融合DNMT3L释放DNMT3A自抑制，招募内源机制。在去甲基化方面，2013年Maeder等将TET1催化域融合到TALE实现去甲基化；2016年Liu等展示了CRISPR-TET编辑器在培养细胞和体内的靶向去甲基化与基因激活。

DNA甲基化编辑的治疗应用（Therapeutic use of DNA methylation editing）。Pcsk9沉默是代表性案例。Cappelluti等在小鼠肝脏中实现了近一年的稳定沉默，部分肝切除后仍保持；Tremblay等进一步在非人灵长类中单次给药后实现循环PCSK9和低密度脂蛋白胆固醇持久降低。CHARM在小鼠脑中使神经元朊蛋白表达降低达80%。CRISPRoff在胶质母细胞瘤中多靶点持久沉默并增加化疗敏感性。目前已有针对乙型肝炎病毒、面肩肱型肌营养不良症和高胆固醇血症的临床试验（NCT06671093、NCT07200193、NCT06907875、NCT07428473）启动。

利用DNA甲基化编辑的基础生物学研究（Fundamental biology studies harnessing DNA methylation editors）。DNA甲基化编辑被用于疾病建模，如Saunderson等将dCas9-DNMT3A-3L靶向人造血干细胞和祖细胞的CDKN2B（p15）启动子，模拟血液肿瘤中的异常甲基化；另有研究用“打了就跑”表观编辑置换PDGFRA位点绝缘子上的CTCF，模拟特定亚型胶质瘤的甲基化和染色质构象。靶向年龄相关CpG位点可诱导其他年龄相关区域产生协同甲基化变化，提示三维染色质相互作用介导网络效应。Policarpi等研究表明单独建立DNA甲基化即可产生中等程度的转录沉默，且YYI基序可减弱甲基化介导的抑制。Palacios等发现DNA甲基化水平可以连续微调基因表达，而非简单开关。组合编辑揭示UBE2E1的催化活性增强DNMT3A的抑制活性，TET1与RNF20、SMYD1或PRDM1特定结构域融合可增强再激活。Tatarakis等利用KRAB编辑器在小鼠胚胎干细胞中诱导H3K9me3和DNA甲基化，并通过CRISPR-Cas9敲除筛选鉴定异染色质建立和维持所需因子。

脱靶效应评估（Assessment of off-target effects）。脱靶效应包括依赖sgRNA的脱靶结合和非依赖sgRNA的远端甲基化，以及由过表达甲基转移酶非特异活性导致的位点外修饰。DNA甲基化还会向目标位点外扩散数百碱基，可能抑制邻近基因。但部分远端甲基化变化可能源于内源表观遗传网络的协同重连，而非纯技术伪影。区分不同来源的甲基化变化是准确评估特异性的重要挑战。

讨论部分指出，目前大多数研究仍使用癌细胞系、永生化或工程化细胞系，不能完全反映生理状态下的表观遗传动态。随着递送和编辑技术的改进，该技术正扩展到原代细胞、干细胞来源模型和体内组织。未来需要通过改进递送、靶向和蛋白质工程提高编辑效率并减少脱靶，同时深入理解染色质环境、局部序列和酶学特性对编辑结果的影响。人工智能和计算蛋白设计有望加速编辑器优化。结论部分可翻译为：“近年来，由于DNA甲基化在发育、衰老和多种疾病中的动态作用，以及通过位点特异性表观基因组编辑在哺乳动物细胞中进行可编程基因调控的新兴应用，DNA甲基化研究重新引起了人们的兴趣。可编程DNA甲基化编辑的快速进展使得对表观遗传状态的操作日益精准，并确立了这些技术作为基础生物学发现和治疗发展的强大平台。”