《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Comparison of mtLSU-rRNA Gene-Based Real-Time PCR and Nested PCR for the Diagnosis of
Pneumocystis jirovecii Pneumonia in HIV-Negative Patients
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摘要背景与目标耶氏肺孢子虫肺炎（PJP）仍是免疫功能低下患者，尤其是HIV阴性患者发病率和死亡率的主要病因之一。本研究比较了靶向mtLSU-rRNA基因的实时PCR和巢式PCR在检测HIV阴性患者支气管肺泡灌洗液（BAL）标本中耶氏肺孢子虫的诊断性能。方法本研究共分析了196
摘要
背景与目标
耶氏肺孢子虫肺炎（PJP）仍是免疫功能低下患者，尤其是HIV阴性患者发病率和死亡率的主要病因之一。本研究比较了靶向mtLSU-rRNA基因的实时PCR和巢式PCR在检测HIV阴性患者支气管肺泡灌洗液（BAL）标本中耶氏肺孢子虫的诊断性能。
方法
本研究共分析了196例疑似PJP的HIV阴性患者的存档BAL标本，分别采用巢式PCR和靶向同一mtLSU-rRNA基因的实时PCR进行检测。使用Cohen's kappa系数评估一致性，并通过计算阳性百分比一致性（PPA）、阴性百分比一致性（NPA）、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）来评估实时PCR相对于巢式PCR的诊断性能。采用McNemar检验比较不一致结果。
结果
巢式PCR在80/196（40.8%）标本中检测出耶氏肺孢子虫DNA，而实时PCR在79/196（40.3%）标本中检测出阳性。两种方法显示高度一致性（κ = 0.742），总体一致率为87.2%。实时PCR的PPA为83.8%，NPA为89.7%，PPV为84.8%，NPV为88.9%。两种方法之间无显著差异（p > 0.05）。
结论
靶向mtLSU-rRNA基因的实时PCR展现出与巢式PCR可比的诊断性能，同时具有更快的周转时间、更低的污染风险和半定量Ct值评估能力，支持其在PJP常规分子诊断中的应用。
引言
耶氏肺孢子虫肺炎（PJP）仍是免疫功能低下患者最重要的机会性真菌感染之一，尽管在预防和支持治疗方面取得了进展，该病仍与较高的发病率和死亡率相关[1,2]。尽管历史上被认为是艾滋病定义性疾病之一，但过去二十年来PJP的流行病学发生了显著变化。免疫抑制治疗的广泛使用、造血干细胞和实体器官移植、血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的治疗以及长期糖皮质激素治疗，导致HIV阴性免疫功能低下患者中PJP的发病率不断上升[3]。与HIV相关PJP相比，HIV阴性个体的感染通常进展更快、死亡率更高，且由于呼吸道标本中真菌负荷较低而面临更大的诊断挑战。因此，快速准确的实验室诊断对于及时启动适当的抗真菌治疗至关重要。
由于耶氏肺孢子虫无法在体外常规培养，实验室诊断依赖于在呼吸道标本（尤其是支气管肺泡灌洗液BAL中）检测到该病原体。传统的诊断方法，包括组织化学染色和直接免疫荧光显微镜检查，仍然有价值，但敏感性相对较低，尤其在HIV阴性患者中。多项研究表明，HIV阴性患者体内的病原体载量通常显著低于HIV阳性患者，这经常导致显微镜检查出现假阴性结果。因此，单纯依赖显微镜检查可能会延误低真菌负荷患者的诊断和治疗[[4], [5], [6], [7]]。
聚合酶链反应（PCR）方法的引入，通过提供比传统显微镜方法更高的分析敏感性，显著改善了PJP的诊断。在现有的分子技术中，巢式PCR长期以来被认为是最敏感的耶氏肺孢子虫DNA低浓度检测手段之一。其序贯扩增策略能够可靠地检测微量真菌核酸，这使其在临床实践和科研中被广泛用作高敏感性的分子诊断方法。然而，巢式PCR操作繁琐，需要扩增后处理步骤，延长了周转时间，并且由于各轮扩增之间必须重新打开反应管，本质上更易受到扩增产物交叉污染的影响。
实时PCR通过在全封闭管内系统中整合扩增与检测步骤，成为传统PCR和巢式PCR的一种有吸引力的替代方案。这种设计显著降低了实验室污染风险，同时缩短了检测周转时间并减少了手动操作。此外，实时PCR能够实现真菌DNA的定量估算，为在结合临床、影像学和微生物学发现时区分活动性感染与定植提供信息支持。这些操作和分析方面的优势促使许多临床实验室采用实时PCR作为诊断PJP的首选分子平台[1,5,8]。然而，由于实时PCR的分析性能取决于实验设计和实验室验证，其替代巢式PCR用于常规诊断的能力应通过直接比较评估来确定，而非从独立研究中推断得出。
尽管大量研究分别证明了巢式PCR和实时PCR在检测耶氏肺孢子虫方面的高诊断性能，但这两种方法之间的直接头对头比较仍然有限，尤其是在HIV阴性患者中。大多数已发表的研究仅评估了一种分子平台，或使用不同的基因靶标、扩增方案和患者人群进行比较，这使得难以比较其诊断性能。因此，目前仍缺乏充分证据证明实时PCR的实际优势——包括更短的周转时间、更低的污染风险、简化的工作流程和定量能力——是否能在不牺牲传统上与巢式PCR相关的高诊断敏感性的前提下实现。这一问题在HIV阴性患者中尤为重要，因为低真菌负荷对分子诊断方法提出了最高的要求。
为了消除靶标选择对检测性能的影响，本研究评估的两种分子方法均扩增同一多拷贝耶氏肺孢子虫线粒体大亚基核糖体RNA（mtLSU-rRNA）基因。因此，比较的重点在于扩增方法本身的诊断性能，而非归因于分子靶标差异的影响。
因此，本研究的目的是比较基于mtLSU-rRNA基因的实时PCR和巢式PCR在检测HIV阴性疑似PJP患者BAL标本中耶氏肺孢子虫DNA方面的诊断性能。评估了一致性、阳性百分比一致性（PPA）、阴性百分比一致性（NPA）、预测值及总体诊断准确性，以确定实时PCR能否为常规临床诊断提供可靠的实用替代方案。
章节摘要
研究设计
本单中心诊断方法比较研究旨在评估和比较靶向mtLSU-rRNA基因的实时PCR和巢式PCR在检测HIV阴性疑似PJP患者BAL标本中耶氏肺孢子虫的性能。在标准化实验室条件下，采用两种分子检测方法分析了196例存档BAL标本，使得能够对两种方法的诊断性能进行直接比较。
巢式PCR和实时PCR检测耶氏肺孢子虫
本研究纳入了196例疑似耶氏肺孢子虫肺炎的HIV阴性患者的BAL标本，分别采用靶向mtLSU rRNA基因的巢式PCR和实时PCR进行分析。在患者中，124例（63.3%）为男性，72例（36.7%）为女性，中位年龄49岁（范围：19-92岁）。
巢式PCR在80/196（40.8%）标本中检测出耶氏肺孢子虫DNA，而实时PCR在79/196（40.3%）标本中呈阳性。两种分子检测方法显示一致
结论
总之，靶向mtLSU-rRNA基因的实时PCR在检测HIV阴性疑似PJP患者BAL标本中耶氏肺孢子虫DNA方面展现出与巢式PCR的高度一致性和可比性能。尽管巢式PCR的分析敏感性略高，但两种方法之间的差异无统计学显著性。鉴于其全封闭管系统、更低的污染风险、更短的周转时间以及提供半定量
生成式AI和AI辅助技术在稿件准备过程中的声明
在本文准备过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）和Grammarly进行语言编辑和改进最终稿件的可读性。作者对输出内容进行了审查和编辑，并承担已发表文章内容的全部责任。
作者贡献
Esmaeil Eghtedarnejad：方法学；正式分析，调查研究；撰写原稿准备，Hossein Khodadadi：研究设计；概念构思；方法学；资金获取；资源；监督；项目管理；验证；可视化；撰写审阅和编辑，Pariya Kouhi：研究设计；调查研究，Mohammad Javad Fallahi：研究设计；调查研究；验证，Amin Ramezani：方法学，Keyvan Pakshir：调查研究；撰写审阅和编辑，Reza Nasr：
伦理声明
作者未获得参与者或其法定代表人的知情同意。本回顾性研究使用了存档的支气管肺泡灌洗标本和常规临床护理期间收集的完全匿名临床数据。无需额外的干预或患者接触。德黑兰医科大学伦理委员会免除了知情同意的要求（批准编号：IR.SUMS.REC.1402.328），因为研究涉及存档的、
致谢
本研究数据提取自Esmaeil Eghtedarnejad的博士论文，并得到了德黑兰医科大学研究副校长的资助（项目编号28611）。本工作基于伊朗国家科学基金会（INSF）资助的研究，项目编号4027228。
CRediT作者贡献声明
Esmaeil Eghtedarnejad：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿。Hossein Khodadadi：撰写——审阅与编辑，项目管理，资金获取，正式分析，数据整理，概念构思。Pariya Kouhi：方法学，调查研究。Mohammad Javad Fallahi：方法学，调查研究。Amin Ramezani：撰写——审阅与编辑，方法学，调查研究。Keyvan Pakshir：撰写——审阅与编辑，调查研究。Reza Nasr：方法学，调查研究。
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