一种用于pH值和极性检测的可逆双功能荧光探针的简便一步构建方法

《Dyes and Pigments》：Simple one-step construction of a reversible dual-functional fluorescent probe for pH and polarity detection

　　

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  一步合成的双功能探针，用于检测pH值和极性。
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  该探针具有优异的水溶性。
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  使用CS进行pH值和极性检测具有快速且可逆的特点。
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  CS具有出色的选择性和灵敏度。
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  CS已成功应用于实际水样及细胞实验中。

引言

细胞内的pH值和局部极性是调节细胞稳态、酶活性、信号转导和代谢过程的两个基本物理和化学参数[1],[2],[3],[4],[5]。异常的pH值波动与多种病理状况密切相关，包括癌症、阿尔茨海默病和炎症[6],[7],[8],[9],[10],[11]。同时，细胞极性的变化会影響膜流动性、蛋白质折叠以及线粒体和溶酶体等细胞器的微环境，其异常变化也与许多疾病（如阿尔茨海默病、糖尿病、肝硬化和癌症）密切相关[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18]。因此，检测pH值和极性对于理解细胞机制和疾病诊断具有重要意义。由于荧光成像具有高灵敏度、快速响应、操作简单、高分辨率以及非破坏性的优点[19],[20],[21]，它受到了广泛研究。目前，已经开发了许多用于检测pH值[22],[23],[24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]或极性[32],[33],[34],[35],[36],[37],[38],[39]的探针。然而，目前报道的大部分探针都是单功能探针，只能检测单一分析物的变化。通过开发多功能探针，可以实现两种或更多应用方向，并在一定程度上节省物质资源和财务成本。

香豆素衍生物由于其高量子产率、优异的光稳定性和可修饰的结构，已成为荧光探针领域中广泛使用的经典发光骨架[40],[41]。特别是作为典型的溶剂诱导发色基团，香豆素衍生物对溶剂极性的变化非常敏感，常被用于极性探针的设计[42],[43],[44]。吡啶作为一种具有质子接受能力的经典杂环化合物，常被用作构建pH响应荧光系统的响应基团[45],[46],[47]。许多研究报道了香豆素-吡啶共轭荧光分子，但它们的应用主要集中在生物活性小分子（Cys、GSH、SO₂）或单一微环境参数（pH值、极性或粘度）的检测上，很少有研究将其开发成能够同时识别pH值和极性的双功能探针[46],[48],[49],[50],[51],[52]。基于上述经典结构优势并针对现有研究空白，本文通过简单策略一步合成了香豆素-吡啶双功能荧光探针（CS）。该探针具有优异的水溶性，能在水体系中灵敏地响应pH值变化。然而，许多已发表的探针需要有机溶剂的参与（表S1），这与生物系统的环境大相径庭，从而限制了这些探针在生物成像中的应用。目前，用于检测pH值/极性的双功能探针相对较少。与现有探针相比，CS具有更简单的结构和合成工艺、更好的水溶性以及良好的线性范围（表S2）。如图1所示，CS在503?nm处表现出荧光峰，随着极性降低，荧光发射峰逐渐移向470?nm。这是由于CS中存在分子内的电荷转移（ICT）过程：当分子吸收特定波长的光子时，电子从基态迁移到激发态，而环境极性直接影响ICT激发态的稳定性。在高极性环境中，电荷分离状态得到有效稳定，导致荧光发射波长显著红移；而在酸性环境中，吡啶环上的氮原子发生质子化，分子内电荷分离程度进一步增加，增强了ICT过程，使荧光发射峰移向554?nm。相反，在碱性环境中，质子化是可逆的，吡啶失去质子，ICT效应减弱，荧光返回短波长发射，从而实现对pH值的敏感响应。CS通过ICT过程的强弱变化实现了对pH值和极性的双重响应，并伴随颜色的变化、发射波长和荧光强度的变化。受CS优异光谱特性的启发，将其应用于实际水样的酸度和碱度检测以及细胞内极性和pH值的测量，为该探针的实际应用奠定了基础。

节选内容

CS的合成

如方案2所示，CS可通过简单的一步反应获得。将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛（1.932?g，10?mmol）和乙基2-(吡啶-4-基)醋酸酯（1.817?g，11?mmol）溶解在乙醇（20?mL）中，并加入5滴哌啶，回流20?小时。在减压条件下通过真空过滤去除溶剂。粗产物从乙醇中重晶析得到CS（1.647?g，产率56%，黄色固体）。其结构通过IR、¹H NMR、¹³C NMR等进行鉴定。

CS的pH依赖性光谱特性

选择合适的测试系统对于准确评估探针的pH响应行为至关重要。为了选择最优的测试系统，我们系统地评估了不同溶剂系统对探针pH响应性的影响。如图S5所示，在所有测试系统中，探针均表现出一致的pH响应特性。在中性环境（pH?=?7）下，探针显示明显的荧光发射峰。

结论

本研究通过一步合成方法成功将香豆素基团与吡啶单元结合，得到了一种具有pH值和极性双重响应能力的荧光探针。CS通过ICT机制的动态转换实现对pH值和极性的特异性响应。需要强调的是，CS具有优异的水溶性，能够在不需要有机溶剂的情况下快速且灵敏地响应水体系中的pH变化。

CRediT作者贡献声明

Rui-Zhen Zhang：方法学研究、数据整理。 Mei-Ling Zhu：可视化处理、验证、方法学研究。 Yu-Rong Guo:可视化处理、方法学研究、写作与编辑、验证、监督、研究工作及资金申请。

利益冲突声明

作者声明她们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2025QC1382）、国家自然科学基金（T2600520）和齐鲁理工学院研究项目（QIT24TP014）的支持。

Rui-Zhen Zhang|Mei-Ling Zhu|Yu-Rong Guo|Feng Li