环境相关浓度邻苯二甲酸二丁酯（DBP）通过稳定肝细胞来源Lipocalin-2（LCN2）并经24p3R-MMP-9轴促进肝细胞癌（HCC）进展

《Eco-Environment & Health》：Dibutyl phthalate at environmentally relevant concentrations promotes hepatocellular carcinoma progression via stabilization of hepatocyte-derived Lipocalin-2

　　

DBP（邻苯二甲酸二丁酯）调控的肝脏转录靶点主要与HCC（肝细胞癌）相关。DBP通过稳定肝细胞来源的LCN2（Lipocalin-2，脂质运载蛋白2）激活癌细胞增殖。24p3R（24p3受体）-MMP-9（基质金属蛋白酶9）轴参与这种由LCN2触发的癌细胞激活。稳定的DBP-LCN2复合物形成可阻止泛素介导的LCN2降解。

研究背景与问题：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球常见慢性肝病，影响约25%的全球成人，且预计到2050年病例数可达18亿。MASLD包括代谢相关单纯性脂肪肝（MAFL）、代谢相关脂肪性肝炎（MASH）、纤维化、肝硬化和MASH相关HCC。尽管已发现法尼醇X受体（FXR）等靶点及小分子药物，临床有效治疗仍有限。环境污染物是MASLD相关疾病的重要致病因素，其中邻苯二甲酸酯（PAEs）广泛存在于医疗器械、食品包装、玩具和婴儿用品中。DBP被美国环境保护署列为优先污染物，在中国两个城市八类食品中检出率超过90%，饼干中最高浓度为572 ng/g。DBP可与膳食脂质共同经门静脉到达肝脏，促进脂滴积累并诱导肝损伤、炎症和脂质代谢紊乱，但其破坏肝脏代谢稳态并促进MASLD进展的分子通路仍不清楚。肝细胞分泌的肝因子可作为循环信号分子，通过内分泌、自分泌和旁分泌参与组织间通讯。肝脏也是主要解毒器官，通过细胞色素P450（CYP450）和UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）通路清除外源物。因此，研究人员旨在探究肝因子与DBP的相互作用，以识别新型内暴露标志物并阐明MASLD发病机制。该论文发表在《Eco-Environment》。研究结论表明，DBP通过稳定肝细胞来源LCN2促进HCC进展，提示HCC患者应避免DBP或其PAEs类似物暴露，并提示抑制LCN2可能成为高DBP暴露HCC患者的潜在治疗策略。

主要关键技术方法：研究采用雄性C57BL/6J小鼠和BALB/c-nude小鼠，以50 mg/kg DBP灌胃，并建立Huh7细胞皮下异种移植瘤模型；细胞包括小鼠原代肝细胞（MPHs）、HepG2和Huh7。方法包括血清学、H&E、油红O（ORO）、免疫组织化学（IHC）/免疫荧光（IF）、CCK-8、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入、流式细胞术、高通量RNA测序、无标记定量蛋白质组学、GeneCards和OMIM疾病靶点库分析、ELISA、分子对接（MOE）和分子动力学（GROMACS）、TCGA-LIHC队列（HCC n=374，癌旁n=50）、KM Plotter、GEO数据集GSE112790分析、蛋白半衰期追踪、co-IP泛素化分析、shRNA敲低和位点突变验证。

研究结果：
3.1 DBP诱导小鼠肝脏MASLD样表型：通过8周50 mg/kg DBP灌胃，小鼠体重增加13%，摄食和饮水无变化；血清TG升高、AST升高，肝组织脂滴积累，F4/80⁺细胞染色增加，肝TG增加47%，肝TC不变。RNA测序显示232个基因改变，其中124个上调、108个下调，富集于免疫系统过程、脂质代谢、辅因子和维生素代谢、其他氨基酸代谢、外源物生物降解与代谢等通路。GO和Reactome分析确认脂质/脂肪酸代谢与DBP信号显著相关。结论：DBP诱导小鼠肝脏MASLD样表型。

3.2 DBP促进小鼠HCC进展：将208个DBP调控差异表达基因与MASLD进展阶段靶点比较，GeneCards和OMIM数据库识别出4691个MAFL相关靶点、838个MASH相关靶点和11691个HCC相关靶点，DBP改变基因多聚集于HCC靶点。Sankey图显示28个差异基因富集于免疫系统过程、脂质代谢、辅因子和维生素代谢、外源物生物降解与代谢等。Huh7异种移植模型中，DBP增加肿瘤重量和体积，摄食饮水无差异；H&E显示肿瘤细胞致密，IHC显示Ki-67阳性细胞增加。体外高剂量DBP抑制肝癌细胞活力，非细胞毒浓度10 μM不影响Huh7或HepG2增殖。结论：DBP促进小鼠HCC进展而非直接刺激HCC细胞增殖，提示其促瘤效应依赖肝细胞。

3.3 肝细胞来源LCN2响应DBP信号并与HCC进展相关：无标记蛋白质组学显示，10 μM DBP处理MPHs后诱导脂质积累和TG增加，158个蛋白差异表达，其中108个上调、50个下调，通路富集与肝转录组结果一致。将DBP响应蛋白与TCGA数据库交叉，识别出11个表达趋势一致的候选基因，其中仅LCN2具有分泌特性且预测DBP结合亲和力最高（人LCN2 S=-6.0274，小鼠Lcn2 S=-5.8256）。DBP增加MPHs中Lcn2蛋白表达和分泌，不改变LCN2 mRNA；DBP对Huh7或HepG2中LCN2影响较小。TCGA-LIHC显示LCN2 mRNA在肿瘤中高于癌旁，GSE112790中LCN2为HCC进展相关差异基因，且在TCGA-LIHC上调基因中排第169位；高LCN2表达与1期和2期HCC患者总体生存缩短相关，3期关联较弱。结论：肝细胞来源LCN2响应DBP信号并与HCC进展相关。

3.4 肝细胞来源LCN2介导DBP信号促进体外HCC增殖：建立MPHs与Huh7共培养体系，DBP处理MPHs增加Huh7 EdU掺入和S期进入，上调Cyclin E1、CDK2和PCNA，下调p27；LCN2抑制剂ZINC00640089减弱上述促增殖效应。重组人LCN2蛋白（rhLCN2）1 μg/mL处理Huh7可重现EdU增加、S期进入增加及细胞周期相关蛋白变化。结论：LCN2作为旁分泌效应因子介导DBP的促HCC增殖作用。

3.5 LCN2通过24p3R-MMP-9轴促进HCC细胞增殖：在共培养体系中检测24p3R、MMP-9和表皮生长因子受体（EGFR）。DBP处理肝细胞或LCN2抑制剂不改变Huh7中24p3R蛋白表达；shRNA敲低24p3R抑制DBP处理肝细胞诱导的Huh7增殖，降低Cyclin E1、CDK2和PCNA，升高p27。DBP处理肝细胞升高Huh7中MMP-9蛋白，而LCN2抑制剂可阻断该升高；EGFR和磷酸化EGFR水平未改变；24p3R敲低降低MMP-9表达；MMP-9-IN-1抑制HCC增殖和S期进展，类似24p3R缺失效应。结论：肝细胞来源LCN2主要通过24p3R-MMP-9轴促进HCC细胞周期进展。

3.6 DBP通过破坏LCN2泛素化直接结合并稳定LCN2蛋白：DBP在正常小鼠和Huh7异种移植小鼠肝中增加Lcn2蛋白而不影响其mRNA，血清Lcn2升高。200 ns全原子分子动力学模拟显示，DBP稳定结合于LCN2 calyx口袋；界面区原子涨落受限，人LCN2的RMSD稳定，Rg和SASA下降并稳定于约1.7 nm和115 nm²，DBP-LCN2复合物变化与LCN2一致，接触表面积稳定在约3.0 nm²，氢键持续，自由能景观呈单一深能量盆地。蛋白半衰期实验显示DBP将Lcn2半衰期延长至3.17 h。分子对接预测DBP结合人LCN2的Lys145和Lys154；突变增加S值并降低结合亲和力，SOPMA预测二级结构不受影响；MG132增强DBP诱导的Lcn2稳定性。单突变部分减弱、双突变完全消除DBP诱导的LCN2稳定化和泛素化抑制。结论：Lys145和Lys154是DBP-LCN2直接相互作用的关键残基，DBP通过抑制泛素化稳定LCN2。

讨论与结论：讨论部分指出，人群广泛长期暴露于DBP，DBP与人类肝脏肿瘤和成人MASLD相关，但直接靶点和机制不明。本研究中，DBP促进HCC进展但不刺激HCC细胞增殖，提示HCC细胞不是DBP直接靶点；DBP改变的外源物代谢基因主要富集于肝细胞，因此其促瘤效应依赖肝细胞及分泌的肝因子。研究人员通过无标记蛋白质组学、MOE软件和TCGA数据库识别肝细胞来源LCN2为DBP功能效应因子，LCN2表达与1期和2期HCC患者总体生存负相关。肝细胞-HCC细胞共培养显示，ZINC00640089抑制LCN2可部分消除DBP处理肝细胞诱导的HCC增殖。机制上，DBP-LCN2复合物具有良好动力学和结构稳定性，DBP结合赖氨酸残基减少LCN2泛素化。50 mg/(kg·d)小鼠剂量按FDA/ICH人体等效剂量（HED）换算约相当于人4.05 mg/(kg·d)，处于环境相关高暴露范围，远低于明显毒性水平。DBP可因抑制过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）信号导致脂肪酸氧化受损，并上调Ccl2、Ccl5、Cxcl1、Cxcl9、Cxcl10等免疫炎症基因。LCN2又称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL），在HCC中具有临床意义，血清LCN2超过225 ng/mL对HCC具有诊断效能。LCN2 mRNA与蛋白表达差异可由bulk RNA-seq混合肿瘤、癌旁肝细胞和免疫浸润信号以及时空异质性解释。LCN2的“双刃剑”效应由细胞来源、肿瘤阶段和局部铁状态决定；本研究中肝细胞来源LCN2作为微环境驱动因子，通过24p3R-MMP-9轴促进HCC。DBP代谢物单丁基邻苯二甲酸酯（MBP）可能在晚期HCC中通过胆固醇合成和免疫抑制重编程促进进展，而DBP因其经门静脉首过暴露和较高脂水分配系数（log K_ow）更符合早期直接结合LCN2的机制。肿瘤微环境（TME）中，DBP可能减少CD8⁺ T细胞和γδ T细胞，增加Kupffer细胞和单核来源巨噬细胞；LCN2可通过铁隔离损害CD8⁺ T细胞功能，并通过CXCR2促进巨噬细胞M2样极化。研究局限在于异种移植模型不能完全复现MASLD驱动肝癌发生，未来需肝细胞特异性Lcn2敲除小鼠和MASLD-HCC模型验证。研究结论翻译：总之，该研究揭示LCN2作为DBP在肝细胞中的潜在靶点，转导DBP信号以促进HCC进展。这些发现表明DBP暴露可能加速肝癌进展，提示HCC患者应避免暴露于DBP或其PAEs类似物。因此，未来研究应关注DBP对HCC治疗效果的影响。此外，抑制LCN2可能成为高DBP暴露水平HCC患者的潜在治疗策略。