DES经雌激素受体α依赖性机制促进子宫内膜癌发生的体内研究

《European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology: X》：Estrogen Receptor-Dependent Mechanisms Underlying DES promoted Endometrial Carcinoma: Study In Vivo

　　

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）是一种合成雌激素，因其在子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）发生中的致癌作用而受到广泛研究。DES的作用通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）通路介导，该通路在子宫内膜细胞的分化、增殖和转化中发挥关键作用。已有研究表明，雌激素及其受体在EC的发生和进展中至关重要。例如，Kabbarah等人证实，DES处理小鼠可导致与雌激素促肿瘤作用相关的显著基因表达改变，强调了ER通路在子宫内膜癌变中的重要性。此外，已有研究证明ER表达水平与从正常子宫内膜到增生乃至最终癌变的组织病理学进展之间存在直接关系，Guo等人指出，这些变化的复杂性提示ERα和ERβ可能影响子宫内膜肿瘤行为的不同方面，从而促成人类子宫内膜肿瘤中观察到的多样化病理状态。发育关键期的激素环境被认为可改变EC的发病风险。证据表明，当雌激素缺乏孕激素拮抗时，可诱导致癌环境。研究显示，高雌激素水平与EC风险增加及肿瘤侵袭性显著相关。此外，DES对子宫内膜微环境的影响，如上调基质金属蛋白酶和促进血管生成，凸显了DES诱导癌变的多面性。本研究深入探讨了ER依赖性机制与DES在子宫内膜中致癌作用之间的复杂联系，为所涉及的生物学通路及EC临床管理的更广泛意义提供了见解。通过阐明ER表达如何影响DES介导的子宫内膜癌变，研究人员希望增进对该疾病的理解，并促进靶向预防和治疗策略的开发。

研究背景与目的

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）作为一种合成雌激素，其致癌性尤其是与子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）的关联已被广泛研究。既往研究表明，雌激素及其受体在EC的发生与进展中起关键作用，DES的效应主要通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）通路介导，影响子宫内膜细胞的分化、增殖与转化。已有实验证实DES处理可导致小鼠基因表达改变，并观察到ER表达水平与子宫内膜从正常状态经增生至癌变的组织病理学进展存在直接关联。此外，缺乏孕激素拮抗的雌激素环境被认为可诱导致癌微环境，高雌激素水平与EC风险增加及肿瘤侵袭性显著相关。DES还可通过上调基质金属蛋白酶、促进血管生成等方式影响子宫内膜微环境。然而，ER依赖性机制在DES诱导子宫内膜癌变过程中的具体作用模式及时序特征仍需深入阐明。为此，研究人员开展了本项体内研究，旨在探讨DES暴露、ERα表达与EC组织病理学进展之间的关系，为理解雌激素信号在DES相关EC中的驱动作用及临床管理提供依据。

研究设计与方法

本研究经Universitas Airlangga兽医学院伦理委员会批准。实验采用32只8周龄雌性小鼠，随机分为8组，每组4只。其中2组为未处理对照组（观察10天和15天），其余6组接受1000 μg DES处理，并按不同处理与观察时间方案分组。DES剂量选择基于既往雌激素诱导癌变的实验模型。实验终点时以CO?窒息法处死小鼠，采集子宫组织，经10%中性缓冲福尔马林固定、常规组织学处理、6 μm纵切后，行苏木精-伊红（HE）染色用于组织病理学评估，或留作免疫组织化学分析。组织病理学分级依据国际妇产科联盟（FIGO）子宫内膜癌分级系统，由对分组设盲的兽医病理学家独立评估。ERα表达采用免疫组织化学染色，依据改良Remmele法进行免疫反应评分（IRS）半定量评估，每样本在400×倍率下取5个高倍视野（HPF）计算平均分。统计分析方面，样本量依据连续结局独立组比较的参数估计公式计算，每组最小样本量为3.499，取整为4只。ERα评分经Shapiro–Wilk检验和Levene检验确认正态性与方差齐性后，采用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异，显著时以Tukey HSD检验进行事后两两比较。组织病理学分级作为有序变量，采用Kruskal–Wallis检验评估组间差异，显著时以Mann–Whitney U检验进行两两比较。此外，通过路径分析评估DES暴露、ERα表达与EC结局之间的直接与间接效应关系。

研究结果

雌激素受体α表达

共32份标本（K1、K2、P1.1、P1.2、P2.1、P2.2、P3.1、P3.2，每组n=4）纳入ERα表达分析。描述性分析显示组间ERα评分存在显著差异，均值范围为P3.1组的0.85 ± 0.72至P2.2组的5.40 ± 2.26。对照组（K1、K2）呈中等程度ERα表达（均值分别为3.60 ± 2.08和2.50 ± 1.55），而实验强度较高的处理组（尤其P2.2和P3.2）受体表达显著升高。Shapiro–Wilk检验显示各组数据符合正态分布（p > 0.05），Levene检验确认方差齐性（p = 0.330）。单因素方差分析显示组间ERα表达差异显著（F = 4.255，p = 0.003）。Tukey HSD事后检验显示，P2.2组ERα表达显著高于P2.1组（均值差=4.45，p = 0.017）和P3.1组（均值差=4.55，p = 0.014），其余组间比较未达统计学显著。结果表明ERα表达与暴露时长和观察周期均相关。

组织病理学结果与分级

组织病理学评估显示各组子宫内膜异常呈渐进性发展。对照组（K1、K2）以正常组织学为主（75%），偶见1级改变（25%）。处理组高级别病变频率增加，其中P2.2组病变最严重，75%标本被归为3级；P1.2和P3.2组分别以2级病变为主（75%和50%）。Kruskal–Wallis检验确认组间组织病理学分级差异显著（H = 23.604，p = 0.001）。Mann–Whitney两两比较显示，P1.1、P1.2、P2.2和P3.2组与对照组（K1、K2）差异显著，支持处理相关的病理严重程度升级。肉眼观察显示，对照组子宫形态无明显异常，而P2.2组子宫增大，黏膜和浆膜面充血，并可见病理性肿块。组织病理学检查显示DES处理组子宫组织存在多种上皮和腺体异常，包括非典型子宫内膜上皮增生、核极性改变、异质性上皮形态，以及绒毛腺样、乳头状和黏液样特征区域。免疫组织化学染色显示ERα在子宫上皮细胞和子宫内膜腺体细胞中表达。

DES暴露、ERα表达与EC的路径分析

路径分析以雌激素受体1（EsR1）为潜在中介变量，评估DES暴露对子宫内膜癌的直接和间接效应。模型显示各变量间存在显著通路：DES暴露对EsR1表达有显著正向效应（β = 0.384，p = 0.002），表明DES上调雌激素受体信号；EsR1表达与子宫内膜癌风险增加显著相关（β = 0.482，p = 0.001），提示其在肿瘤发展中的关键作用；DES对子宫内膜癌存在直接效应（β = 0.232），表明DES通过受体依赖和非受体依赖两种机制促进癌变。DES经EsR1对子宫内膜癌的间接效应为0.185，反映EsR1在该关系中具有实质性中介作用。上述结果表明EsR1部分中介DES对子宫内膜癌发展的效应，直接与间接通路共同构成总体效应。

讨论与结论

本研究证实DES诱导的子宫内膜癌变以ERα表达的动态非线性调节为特征，该调节与组织病理学肿瘤进展和侵袭性分级恶化密切平行。路径分析结果支持DES与ERα表达及ERα下游对EC结局的效应之间存在关联，与既往关于新生儿DES暴露的不良生殖道后果依赖ERα的实验证据一致。机制层面，DES作为合成非甾体雌激素，在缺乏孕激素拮抗（无拮抗雌激素）的情况下通过延长雌激素刺激发挥致癌作用，经基因组通路结合雌激素受体、二聚化并转位至核内，结合雌激素反应元件（EREs）作为转录因子，促进有丝分裂信号、DNA损伤和表观遗传改变。DES还可调节Wnt/β-catenin信号通路，导致Ki-67等增殖标志物过表达。此外，雌激素通过膜结合雌激素受体与受体酪氨酸激酶（RTKs）如IGF-1R和ErbB2/HER2相互作用，激活PI3K和MAPK下游信号通路，促进细胞存活和增殖。发育期暴露于DES等内分泌活性化合物与成年组织持久的DNA甲基化和转录组改变相关，ERα参与介导这些长期分子效应。近期研究亦表明，视黄酸（RA）信号拮抗雌激素信号以维持成体子宫细胞命运，新生儿期DES暴露扰乱该平衡，导致正常上皮稳态丧失。值得注意的是，ERα与肿瘤侵袭性的关系具有情境依赖性，ERα在分化良好的病变中可保留表达，并随肿瘤去分化而下降。本研究的分级组织病理学与ERα模式可能反映雌激素依赖轨迹中ERα上调促进病变启动和进展的实验窗口期。本研究的局限性包括未正式评估观察者内和观察者间变异，可能引入测量偏倚；为减少变异，所有评估均采用标准化方案并由两名独立经验丰富的研究者完成。未来需更大样本量和正式可重复性评估以验证结果。综合来看，本研究支持DES作为强效雌激素性启动因子通过ER介导机制启动子宫内膜癌变，而延长暴露促进分子重编程和ER下调，进而促进肿瘤进展和侵袭性。结论为：DES在体内通过ERα依赖性机制与子宫内膜癌变相关，ERα表达升高与组织病理学进展平行，机制分析提示ERα是连接合成雌激素暴露与肿瘤发展的关键中介因子，这些发现强调了雌激素信号在DES诱导EC中的核心作用。