《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》：Electrospun-lyophilized chitosan wound dressings for dual bioactive delivery of hyaluronic acid and IL-6
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创面愈合是一个复杂且高度调控的细胞过程，尽管其临床负担巨大，但治疗干预手段有限。目前的研究转向内源性生物分子作为有前景的创面愈合候选物，包括透明质酸和白细胞介素-6。然而，尽管这些分子具有临床潜力，但由于其脆弱性，带来了显著的技术挑战，限制了其临床应用。为克服
创面愈合是一个复杂且高度调控的细胞过程，尽管其临床负担巨大，但治疗干预手段有限。目前的研究转向内源性生物分子作为有前景的创面愈合候选物，包括透明质酸和白细胞介素-6。然而，尽管这些分子具有临床潜力，但由于其脆弱性，带来了显著的技术挑战，限制了其临床应用。为克服这些限制，研究人员开发了一种结合静电纺丝和冷冻干燥的双层创面敷料。壳聚糖纳米纤维垫作为物理屏障，而透明质酸和白细胞介素-6通过冷冻干燥转化为亲水性促创面愈合层，实现白细胞介素-6的即时和创面阶段特异性递送。透明质酸作为白细胞介素-6的稳定剂，将其回收率提高约30%，并增强初始储存稳定性。该创面敷料表现出高生物相容性，细胞活力为126%，与对照相比，48小时后残余创面面积减少且创面闭合加速超过40%。此外，壳聚糖对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）具有明显的抗菌活性，并通过透明质酸增加氨基质子化而进一步增强。这些结果为该双层系统作为稳定有效递送脆弱生物分子的多功能平台、实现现代创面疗法提供了概念验证。
**论文解读：静电纺丝-冻干壳聚糖双层创面敷料用于透明质酸和IL-6双重生物活性递送**
**1. 研究背景与问题**
急性创面的有效治疗对于防止并发症和向慢性创面进展至关重要，慢性创面与持续炎症、感染风险增加和组织修复延迟相关，约影响1%的人口，给患者和医疗系统带来显著负担。标准疗法疗效有限，因此内源性生物大分子如细胞因子、生长因子和多糖因能主动调节愈合级联反应的不同阶段而受到关注。白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）是一种多功能细胞因子，在创面愈合早期发挥瞬时调节作用，驱动从炎症向组织修复的转变；透明质酸（hyaluronic acid, HA）是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的关键成分，具有强水结合能力，促进湿性创面环境形成，有利于角质形成细胞迁移和减少疤痕。两者联合应用具有协同促创面愈合作用。然而，这些分子对环境应激高度敏感，在蛋白水解和氧化性创面渗出液中会迅速降解，限制其临床应用。静电纺丝纳米纤维敷料因结构类似天然ECM而成为有前景的递送平台，但将HA和IL-6直接电纺面临有机溶剂、高压等苛刻条件，可能损害其生物活性。同轴电纺虽能保护分子，但可能限制快速直接的生物利用度。冷冻干燥可将脆弱分子嵌入无定形多孔结构，实现长期保存和快速溶解，从而提供即时生物利用度。因此，研究人员旨在开发一种结合静电纺丝和冷冻干燥的双层创面敷料。
**2. 研究内容与结论**
研究人员以低分子量壳聚糖（chitosan, CS）为原料，通过静电纺丝制备纳米纤维垫，并用戊二醛（glutaraldehyde, GA）交联得到不溶性CS层（CSCL）。随后将高分子量HA、IL-6和吐温80（Tween? 80, T80）的水溶液施加在CSCL上，经冷冻干燥形成双层敷料。共制备四种配方：空白CSCLB、含HA的CSCLH、含IL-6的CSCLI、含两者组合的CSCLHI。每种敷料含0.6 mg CS、0.3 mg HA和3 ng IL-6。体外实验使用人永生化角质形成细胞系HaCaT（由CLS Cell Lines Service GmbH提供，源自德国癌症研究中心N. Fusenig教授建立的原始细胞系）。
**3. 关键技术与方法**
主要技术方法包括：静电纺丝制备CS纳米纤维垫，冷冻干燥构建载药层；扫描电子显微镜（SEM）表征形态和纤维直径；单轴拉伸测试评估力学性能（极限抗拉强度、弹性模量、断裂伸长率）；光学接触角测角仪测量润湿性；咔唑法（carbazole assay）定量HA，酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量IL-6；MTT法检测细胞活力；划痕实验评估创面愈合；抑菌圈实验评估对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的抗菌活性。细菌菌株来自莱布尼茨研究所DSMZ，细胞系来源已注明。
**4. 研究结果**
4.1 形态学表征：SEM显示随机排列的纳米纤维，表面光滑，直径分布均匀。交联未改变纤维整体结构。含HA的配方CSCLH和CSCLHI呈现轻微溶胀的纤维，形成连贯的高度开孔顶层基质。定量分析显示，所有组纤维直径无显著差异（CS: 0.68±0.35 μm；CSCL: 0.65±0.32 μm；双层配方在0.53-0.63 μm之间）。
4.2 力学性能和亲水性测试：交联显著降低了断裂伸长率（从15.19%降至10.02%），E-模量有增加趋势。双层配方的E-模量显著增加，其中含HA配方增幅较小。HA层配方表现出顺序失效行为，出现阶梯式下降。所有样品接触角低于90°，均为亲水性。交联后初始接触角从53.9°增至86.6°，但HA配方接触角下降更快，表明吸水更快。
4.3 回收率和稳定性研究：HA回收率在CSCLH和CSCLHI中分别为94.24%和95.04%，几乎完全回收。IL-6回收率在CSCLI中为53.84%，在CSCLHI中显著提高至81.37%，表明HA对IL-6有冻干保护作用。在28天储存中，HA在所有条件下保持稳定。IL-6在无HA时降解显著，如室温下含量下降60.31%，而在HA存在下仅下降28.52%；在-20°C下，CSCLHI中IL-6含量几乎不变（下降0.23%），而无HA时下降37.41%。释放研究显示快速爆发释放：HA在5分钟内释放90.92%，IL-6在15分钟内释放84.45%，随后HA释放达到平台，IL-6在24小时数值略低但无统计学差异。
4.4 生物相容性和创面愈合效果：MTT实验显示，在1×浓度下所有配方细胞活力均高于95%。CSCLH和CSCLHI呈浓度依赖性增加，CSCLHI在4×浓度下活力达129.11%。CSCLI在低浓度时无毒，但在4×浓度下降至75.31%。划痕实验中，所有处理均加速创面闭合。CSCLHI效果最佳，48小时残余创面面积降至6.67%，72小时完全闭合，而对照组72小时残余面积29.25%。CSCLH和CSCLI也显著优于对照。
4.5 抗菌效果：所有配方对两种细菌均产生抑菌圈。对P. aeruginosa，CSCLB和CSCLI抑菌圈约9.5 mm，而含HA的CSCLH和CSCLHI约11.7-11.9 mm，显著增大。对S. aureus趋势相似，含HA配方抑菌圈最大（12.2 mm）。抗菌活性主要来自CS的质子化氨基，HA可能通过降低局部pH增加氨基质子化而增强效果。
**5. 讨论与结论**
讨论部分指出，双层系统结合了电纺CS层的ECM样结构和冻干层的快速溶解特性，实现IL-6的即时释放，满足早期炎症阶段特异性递送需求。HA作为冻干保护剂，通过氢键稳定IL-6构象，减少分子移动性，防止聚集。T80作为表面活性剂也保护蛋白。力学性能随交联和冻干而增强，但仍适合临床应用。HA的高分子量形式促进角质形成细胞增殖和迁移，并调节巨噬细胞向抗炎表型转变。IL-6具有窄治疗窗，高浓度可能降低细胞活力，但与HA联用可协同激活ERK信号通路，克服单独使用的局限。抗菌机制基于CS阳离子氨基与细菌表面相互作用，HA增强其质子化。
研究结论：研究人员成功开发了一种双层创面敷料，结合静电纺丝和冷冻干燥技术。电纺CS纳米纤维垫提供机械稳定、生物相容且抗菌的基础层，具有ECM样结构；冻干层由高分子量HA组成，实现脆弱细胞因子IL-6的稳定包载和湿性创面环境形成。HA作为有效冻干保护剂，将IL-6回收率从53.84%提高至81.37%，并在28天内使其含量仅下降0.23%（无HA时下降37.41%）。体外研究显示高生物相容性，细胞活力达126.47%，并显著加速人角质形成细胞创面闭合，48小时残余创面面积从对照的47.88%降至6.67%，表明HA与IL-6之间具有协同促创面愈合作用。该系统为先进生物活性创面敷料提供了新概念，能够有效恢复高脆弱生物分子，并为多功能创面愈合系统的开发提供了通用可转移的平台。
