基于纳米孔技术的STRs、InDel、SNP和mtDNA综合法医检测在身份识别与表型预测中的新进展

《Forensic Science International: Genetics》：A Step Forward in Comprehensive Nanopore-Based Forensic Profiling of STRs, InDel, SNP and mtDNA for Identity and Appearance Prediction

　　

摘要

针对多种DNA标记（包括单核苷酸多态性（SNPs）、插入/缺失多态性（InDels）和DNA甲基化水平）进行靶向分析是法医DNA表型预测的核心内容，能够实现推断生物地理祖源（BGA）、外貌特征和年龄。在常规DNA图谱比对无法识别嫌疑对象时，这类信息具有重要意义。近期的技术发展使得可以在牛津纳米孔技术（ONT）等单一平台上对遗传和表观遗传标记进行长读长分析。与传统毛细管电泳和靶向、短读长大规模平行测序（MPS）方法相比，该方法的优势在于能在一次检测中同时检测遗传和表观遗传标记。

此前，这些用于DNA表型预测的（表观）遗传标记已在ONT MinION平台上进行过评估，而本研究进一步评估了PromethION设备——其孔数更多，可能会带来改进。我们的研究不仅涵盖外貌和祖源预测，还包括世系和个体鉴定。同时采用了全基因组测序（WGS）和自适应采样，在标准（600 ng）和较低输入量（<100 ng）条件下分析了STRs、SNPs、InDels和全mtDNA。随后，我们评估了FDSTools（专为基于MPS的法医标记分析设计的生物信息学工具）和Clair3（用于在长读长数据中识别遗传变异的工具）处理纳米孔测序数据的适用性。

使用FDSTools进行STR等位基因调用，在等位基因平衡阈值设为0.25时取得了最佳性能，在不同实验设置中F1分数对应的准确率范围为89.1–99.2%。对于InDels，FDSTools同样表现最佳，F1分数为98.1%。在应用额外质量阈值后，对1,231个常染色体、X和Y染色体SNP标记的分析达到了98.1–99.8%的F1分数。mtDNA分析显示全mtDNA的F1分数为85.9–88.6%，控制区为100%。总体而言，自适应采样结合标准DNA输入量在所有变异类型中产生了最高的精确度、召回率和F1分数，其次是WGS和较低输入量的自适应采样。尽管由于低水平测序错误导致外貌概率和祖源比例存在轻微变化，但ONT与参考数据之间在外貌和祖源结论上未见差异。我们的研究结果表明，PromethION平台在法医DNA整合分析中具有巨大潜力，能够同时分析用于不同法医目的的多种不同类型遗传标记。

引言

短串联重复序列（STRs）的高度多态性在法医案件中发挥着关键作用，有助于识别微量供体。然而，尽管已有稳健可靠的聚合酶链反应（PCR）多重扩增和毛细管电泳（CE）技术，所生成的DNA图谱可能无法与犯罪分子或受害者匹配，例如当嫌疑人不在场且犯罪者DNA数据库中没有STR匹配时[1], [2]。2024年，据报道荷兰约62%的法医痕迹可在国家犯罪者DNA数据库中找到STR匹配[3]。然而，仍有大量痕迹（包括与潜在嫌疑人相关的痕迹）未获匹配，这表明需要替代方法。

过去几十年中，CE和靶向测序技术（包括大规模平行测序（MPS））的进步推动了法医DNA分析方法的改进，使其应用范围从STR图谱扩展到外部可见特征（EVCs）的预测。这种方法称为法医DNA表型预测（FDP），为调查人员提供额外信息以缩小潜在嫌疑人或受害者群体[4], [5]。FDP分析通常包括对外貌和生物地理祖源的评估，以及表观遗传学年龄估算[1]。虽然头发、眼睛和肤色的预测工具已经成熟[6], [7], [8]，但较新的研究报告了其他外貌特征（如雀斑、眉毛颜色、头发形状、男性型脱发和高大身材）的首个预测模型[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]。此外，生物地理祖源推断依赖于多种祖源信息标记（AIMs），包括常染色体SNPs[16]和插入/缺失（InDels）用于双亲祖源[17]，以及线粒体DNA用于母系祖源（mtDNA）单倍型[18]和Y染色体单倍型用于父系祖源，具有不同地理分辨率[1], [19]。

虽然CE和标准靶向MPS方法仍是法医DNA分析的黄金标准，但在同时分析多种（表观）遗传标记方面，它们在成本和时间效率上往往不够理想。靶向MPS的发展允许将不同类型和用途的标记组合在一起，包括ForenSeq DNA Signature Prep Kit，该试剂盒靶向SNPs和STRs[20]。其他检测方案将甲基化敏感限制酶与SNP/微单倍型分型相结合用于FDP，或使用靶向MPS方案结合数百个SNP进行外貌预测，同时推断双亲和非双亲祖源[21], [22]。然而，这些方法仅限于靶向不超过两种（表观）遗传标记类型。因此，近期研究开始探索替代测序技术以实现更广泛标记类型和更多标记数量的同时分析，包括牛津纳米孔技术（ONT）引入的长读长测序[23]。

ONT设备使用嵌入蛋白质复合体（称为纳米孔）的膜，在单链DNA分子通过孔道时检测离子电流变化。经过专门训练的机器学习算法解释这些扰动并将其转化为正序和修饰序列数据[23]。ONT平台的优点包括实施成本低、样品处理简单直接、长读长DNA分子的实时碱基调用，以及可能进行直接测序而无需任何扩增或转化步骤。此外，ONT的自适应采样策略通过实时测序分类高效进行靶向测序，选择性保留目标分子，同时将非目标分子从纳米孔中排出。ONT的另一项可有利于法医分析的特征是，与用于其他技术（MPS）的机器相比，纳米孔设备体积更为紧凑。这使得ONT可以便携至法医相关场所，如灾难现场的法医人类学鉴定（DVI）[24]。

多项研究表明，纳米孔设备在法医用途（包括用于个体鉴定的STRs和SNPs[24], [25], [26], [27], [28], [29]，以及用于表型预测[30]和祖源推断的SNPs[31]）的测序准确性方面前景广阔。最近，（de Bruin等人 2025）在一项概念验证研究中展示了纳米孔测序将法医STRs、SNPs、InDels和DNA甲基化标记整合到单一检测方案中的潜力，使用了自适应采样和MinION纳米孔直接测序[32]。然而，平台和数据分析优化以及改进的数量和质量阈值仍然至关重要。

除MinION设备外，牛津纳米孔技术还推出了PromethION平台。凭借其显著更多的纳米孔数量（约12,000个，而MinION为3,000个），PromethION有可能增加每个位点的测序读长深度。缺点是与其他MPS技术相比测序错误率较高，尽管ONT测序准确性正在提高[33], [34]。最近的研究表明，PromethION在测序DNA甲基化标记（用于年龄预测和体液识别的综合目的）方面的读长深度和准确性相对于MinION平台有所改善（Beentjes等人 2025）[35]。这些发现令人期待，PromethION的使用可能同样提高读长深度，从而提高其他法医遗传DNA标记的准确性。

在本研究中，我们通过靶向大量法医遗传标记（包括STRs、SNPs和InDels，用于个体鉴定、世系确定、外貌预测和生物地理祖源推断），利用全面的纳米孔检测方案评估了PromethION平台增强的测序深度。我们的目标是评估测序覆盖度和技术性能，并使用不同的生物信息学工具及设置额外阈值来优化STRs、SNPs和InDels的评估。此外，我们还评估了该方法在标准（600 ng）和降低DNA输入量（<100 ng）条件下的稳健性，以期为未来的法医应用提供参考建议。

章节片段

样品选择、表型收集、伦理批准和DNA提取

使用FlexSTAR工作流（AutoGen，美国霍利斯顿）从全血（采集于EDTA涂层管中）提取了5名无亲缘关系男性和2名女性的DNA。完整样品概述见补充表1。样品已匿名处理，并为优化和验证ONT PromethION 2（英国牛津，牛津纳米孔技术公司）获得了书面知情同意。样品由（审稿后补充）采集，仅使用匿名标识符。

样品描述和测序运行详情

本研究基于ONT PromethION平台进行了两种方式测序——WGS和自适应采样，对7名个体（年龄22–56岁）中超过1,300个不同类型的遗传标记进行分析，用于不同的法医目的。测序前评估了流控芯片孔数量和品质。关于流控芯片性能、测序深度和靶向效率的详细概述见Beentjes等人（2025）[35]。在7次WGS运行中，活动孔数量范围为5,477个至…

结论

本研究证明了ONT PromethION测序用于法医DNA标记整合分析的可行性。无论在全基因组测序还是自适应采样中，STRs、SNPs和InDels均在单一工作流程中成功表征，与参考数据高度一致。在所评估的方法中，FDSTools的bam2fds通常为STR、InDel、SNP和mtDNA变异检测提供了最高的F1分数、精确度和召回率，而Clair3提供的结果相当。

伦理声明

所有参与者或其法定代表均已就参与本研究和发表文章获得书面知情同意。参与者的隐私权已得到尊重。

本研究包含器官或组织捐赠者。本研究涉及人类生物材料，已获捐赠者或其近亲或法定代表同意，用于本研究及文章发表。本研究中使用的样品并非来源于已执行死刑…

资助

作者声明，本研究的财务支持由（审稿后补充）提供。本文的撰写和/或发表的财务支持由（审稿后补充）提供。

CRediT作者贡献声明

Peter Henneman：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿、监督、资源、方法学、概念化。Isis Beentjes：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿、可视化、方法学、调查研究、形式化分析、概念化。Genevieve Rice：论文撰写——审阅与编辑。Manfred Kayser：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿、验证、形式化分析、概念化。Arwin Ralf：论文撰写——审阅与编辑、验证、形式…

利益冲突声明

作者声明，他们不存在已知的可能与本文所述工作存在冲突的财务利益或个人关系。

Isis Beentjes|Desiree D.S.H. de Bruin|Martin A. Haagmans|Kristiaan J. van der Gaag|Genevieve Rice|Manfred Kayser|Arwin Ralf|Titia Sijen|Peter Henneman

阿姆斯特丹大学医学中心，人类遗传学系，表观遗传学…，荷兰阿姆斯特丹