基于低深度全基因组测序与基因型填补技术的古代遗骸亲缘关系鉴定——1742年挪威Kjervik谋杀案嫌犯遗骸的遗传学确认

《Forensic Science International: Genetics》：300Exhaustive measures to identify historical remains

　　

对1946年出土的两具遗骸进行了全面的遗传学调查，这两具遗骸疑似为1742年因谋杀被处决的一对臭名昭著的兄妹。研究人员为每具遗骸制备并测序了四个文库，获得了平均4倍和14倍的基因组覆盖度。数据显示细菌含量高且非特异性序列量大，仅有5-10%的读段比对到人类基因组，同时重复率较高（44%至76%）。在当地历史学家小组的协助下，研究人员找到了这对兄妹的十位远房后代并采集了样本。利用覆盖超过600,000个单核苷酸多态性标记（SNP markers）的GSA微阵列芯片，对10份参考样本和35位来自挪威人群的无血缘个体进行了分析。为了扩充数据并提高骨骼全基因组测序数据与参考个体之间的重叠度，研究人员利用千人基因组计划（1000 Genomes，1000G）中的2504个个体作为参考面板，对高质量的微阵列数据进行基因型填补（genotype imputation）。结合IBD片段匹配（IBD-segment matching）与传统似然比（likelihood ratio）方法，综合结果为所提出的遗骸身份鉴定提供了强有力的遗传学支持。本研究展示了新兴基因分型方法结合先进亲缘关系推断技术的潜力，其发现可为法医遗传学领域的未来应用提供知识支撑。

研究背景与科学问题

在法医遗传学和古DNA研究中，对年代久远、高度降解的人类遗骸进行身份鉴定一直是极具挑战性的课题。本研究的对象是1946年在挪威北部吉斯海峡一座小岛上发现的两具骨骸。最初怀疑是二战德国占领挪威后留下的遗骸，但当地警方很快判定其年代更为久远。此后数十年间，这些遗骸的身份一直成谜。直到一群地方史学家提出假说，认为它们可能与当地著名的“Kjervik谋杀案”有关。据记载，1733年当地居民Jens Olsen被发现死于头部钝器伤，其妻Birte Olsdatter和妻弟Benjamin Olsen被控谋杀后逃亡，最终被捕并处决。传说中Birte的头颅被插在Ry?ya岛的木桩上，而该岛距离遗骸发现地约25公里。然而，碳-14测年结果极不精确，将死亡时间锁定在1650年至1946年间，无法提供可靠判断。

此前的法医学研究表明，对于第三代表亲至第四代表亲这类远亲关系，基于脱氧核糖核酸（DNA）的亲缘推断已接近可检测的极限。例如，约75.5%的第三代表亲可通过似然比方法正确分类，而第四代表亲中只有70%会共享某些血缘同源（IBD）片段。更棘手的是，本研究所涉遗骸保存状况极差——骨骼变色脆弱，DNA严重降解，且缺乏已知来源于这对兄妹的参照样本。线粒体（mt）和Y染色体等谱系标记在此复杂家系中也几乎无信息量，唯有常染色体和X染色体标记可供利用。因此，如何在极低质量数据条件下，从跨越8-10代的庞大谱系中精准识别远亲关系，成为亟待解决的核心科学难题。

研究内容与主要结论

研究人员针对上述难题，采用了一套多层次、多方法的综合策略。首先，通过短串联重复序列（STR）分析确认两具遗骸为全同胞兄妹关系。随后，对遗骸进行全基因组测序（WGS）和杂交捕获测序，并结合高密度单核苷酸多态性（SNP）微阵列芯片对10位潜在后代亲属和35位挪威无关个体进行基因分型。利用千人基因组计划（1000G）参考面板对数据进行基因型填补（imputation），大幅提升了数据重叠度和可用信息量。在此基础上，同时运用两种互补的分析路径：一是基于IBD片段检测的方法（包括相位自由的IBIS和基于相位的ancIBD），二是基于似然比计算的参数化方法（包括Merlin和适用于低深度数据的lcNGS）。通过对多种参数组合的系统优化和交叉验证，研究人员得出了强有力的结论：所有证据均一致支持这两具遗骸正是1742年被处决的Birte Olsdatter和Benjamin Olsen兄妹，从而为这一流传近三百年的历史悬案画上了句号。该研究不仅成功解决了具体案件，更证明了新兴基因分型和亲缘推断技术在极端困难条件下的巨大潜力，为法医遗传学的未来应用奠定了重要基础。

关键技术方法

1. 1.
   DNA提取与文库构建：采用Amory等人方案从股骨样本提取DNA，使用ThruPLEX低起始量试剂盒构建测序文库，并通过Covaris超声破碎仪进行片段化处理。
2. 2.
   全基因组测序与杂交捕获：先进行预实验（NovaSeq 6000 SP流动槽），后进行深度测序（S4流动槽，v1.5化学试剂）；另定制Twist Bioscience杂交捕获面板（含约130万个SNP，包括32670个Y-SNP），用于靶向富集和验证。
3. 3.
   微阵列基因分型：使用Infinium Global Screening Array芯片（覆盖超过60万SNP）对10位后代亲属（由Lenvik Historielag地方历史学会追踪构建的10代家系）及35位挪威无关个体进行分析。
4. 4.
   生物信息学与基因型填补：使用AdapterRemoval、bwa、GATK、Samtools等工具处理原始数据；利用GLIMPSE2软件，以1000G Phase 3为参考面板进行基因型填补，并将后验概率阈值设为0.99。
5. 5.
   亲缘关系推断：采用四种方法——IBIS（相位自由IBD片段检测）、ancIBD（基于相位的IBD片段检测）、Merlin（硬基因型似然比计算）和lcNGS（基于基因型似然的低深度数据似然比计算），通过多参数网格搜索优化设置以减少假阳性。

研究结果

3.1 STR分析

通过对男性遗骸（获得30个常染色体和3个Y染色体标记）和女性遗骸（获得17个常染色体标记）的STR分型，基于17个重叠标记的似然比分析表明，两具遗骸为全同胞兄妹的可能性是半同胞关系的4450倍，是无关个体的1.189×10⁸倍，有力排除了其他亲缘假设。

3.2 SNP分析

测序结果显示DNA高度降解：女性遗骸（BoneF）平均覆盖度4.25倍，比对率仅6.74%，重复率高达74%；男性遗骸（BoneM）平均覆盖度14.25倍，比对率9.84%，重复率52%。杂交捕获显著提高了人源序列比例（BoneF达45%，BoneM达27%）。

在IBD片段检测方面，IBIS和ancIBD均显示两具遗骸共享约2415厘摩（cM）的IBD片段，符合全同胞关系。后代亲属8号和9号与遗骸共享26-68 cM，对应预期的第三代表亲关系。在似然比分析中，经严格参数筛选（MAF=0.4，r²=0.2），Merlin和lcNGS均证实两具遗骸为全同胞，且亲属8号和9号与男性遗骸的对数似然比（logLR）大于7，呈强阳性匹配。联合多位点家系分析进一步强化了证据：将亲属8号和9号同时纳入家系的似然比对数达到56。

主成分分析（PCA）显示两具遗骸均聚类于北欧人群。男性遗骸的Y染色体单倍群确定为R1b1a1b1a1a2c1a1f（R1b-L1335），常见于不列颠群岛；两具遗骸共享相同的线粒体单倍群H28a，已在挪威人群中被报道，且污染检测为阴性。

讨论与结论

讨论部分指出，尽管两具遗骸的比对率很低（6.74%-9.84%），可能源于超声破碎导致过短片段无法比对，但杂交捕获技术显著提升了数据质量，展示了其在法医学中的应用前景。谱系标记在本研究中价值有限，因为缺乏与目标个体共享母系或父系的后代，只能提供粗略的祖先溯源信息。

关于IBD检测的差异，研究人员分析了三种可能原因：相位信息缺失、ancIBD所用SNP密度较低、或IBIS可能因过度填补产生虚假片段。值得注意的是，当单个文库平均深度低于1倍时，IBIS的片段匹配结果不可靠，这为后续研究设定了重要的质量阈值。

研究人员强调，似然比方法易受家系错误假设的影响，尤其是在涉及多个世代连接的复杂案件中。为此，他们使用了多位参考个体来降低单一谱系错误的风险。基因型填补虽能增强数据，但也可能放大误差，使个体显得更亲近，因此必须配合无关对照样本进行校准。模拟分析显示，第七代亲属中有1.1%完全不共享IBD片段，7.2%共享片段小于7 cM阈值，这表明研究已处于可检测亲缘关系的理论边缘。

结论部分翻译：

似然比框架能够检测到低至单个SNP的IBD信号，但本研究采用的两种方法各有局限。Merlin需要明确的基因型调用，在处理低质量和/或低数量样本时可能丢失潜在信息。另一种较新且尚未广泛采用的方法lcNGS，在推断多个低质量图谱的家系似然时似乎会产生膨胀的似然比值。尽管如此，由于该方法在读段数据层面直接进行家系似然推断，只要至少有一个图谱质量良好，它可能是偏差最小的方法。虽然这些新方法在应用于实际案件前仍需更多优化和开发验证，但综合结果有力地支持了所提出的历史假说，展示了这些方法和技术在未来法医遗传学应用中的广阔前景。