探索基于响应面法优化的支架在Sprague Dawley大鼠容积型肌肉缺损模型修复中的应用潜力

《Injury》：Harnessing the Potential of Response Surface Methodology-based Optimized Scaffolds in Volumetric Muscle Loss Model Repair in Sprague Dawley Rat

　　

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  开发了一种含有胶原蛋白、纤连蛋白和雷洛昔芬的多孔支架，用于VML修复。
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  使用响应面法（RSM）优化了支架成分。
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  优化后的支架在21天后改善了肌肉再生。
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  观察到肌肉纤维形成增加和胶原蛋白沉积增多。
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  MyoD和STAT3表达增加，表明肌肉修复改善。
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  RSM有助于开发用于VML治疗的有效支架。

引言

骨骼肌是一种高度结构化的组织，对于维持身体功能至关重要。它在轻微损伤后具有内在的修复和再生能力，这主要归功于卫星细胞，卫星细胞是一种驻留在肌纤维表面、基底膜下方的肌肉干细胞[1]。这些卫星细胞增殖并分化为成肌细胞，成肌细胞融合形成新的肌纤维和肌肉组织。然而，在容积性肌肉损失（VML，指骨骼肌体积显著减少，超过20-30%的质量[2]）之后，内在的再生能力严重受损。VML还与纤维性瘢痕形成有关，这进一步损害了卫星细胞介导的再生。VML破坏了肌肉的天然结构，导致严重的功能障碍[3]。VML可发生在战斗和其他高冲击事件中遭受的创伤性损伤之后。它通常影响正常功能需要大量肌肉质量的关键解剖区域[4]，例如，下肢和其他肌肉丰富的解剖区域经常受到影响。

肌肉移植被用作VML的临床治疗方法，然而，供体组织有限仍然是主要挑战。迫切需要替代策略来促进严重损伤后的功能性骨骼肌再生。

VML修复是一个复杂的过程，涉及生长因子、细胞因子、趋化因子、基因和其他信号分子的协调作用。这些因素调节肌肉再生过程中卫星细胞的生长。在分子水平上，PAX7（成对盒蛋白Pax-7）和MyoD（成肌细胞决定蛋白1）作为卫星细胞激活和分化的调节因子发挥着重要作用。当卫星细胞处于静止状态时，它们高表达PAX7而低表达MyoD。然而，当分化为肌肉特异性细胞时，PAX7表达降低，而MyoD表达显著增加[5]。

为了克服现有VML治疗（即肌肉移植）的局限性，基于生物材料的支架已被探索作为支持平台，以促进肌肉组织修复和再生。这些支架可以创建一个临时的、支持性的、类似细胞外基质（ECM）的环境，促进细胞附着、增殖、分化以及随后的组织形成。支架对肌肉再生的有效性取决于支架制造所用的材料、支架架构以及支架与移植细胞之间的相互作用。在我们先前的工作中[6]，我们开发了一种基于胶原蛋白的支架，并使用响应面法（RSM）优化其成分，以促进细胞增殖并增强间充质干细胞（MSCs）的骨骼肌再生潜力[6]。在本研究中，对RSM设计的支架进行了评估，以检验其促进SD大鼠骨骼肌修复和再生的能力。此外，还进行了疗效和安全性研究。

各章节摘要

材料与方法

本研究中使用的所有材料均为标准等级。I型胶原蛋白（来自大鼠尾巴）、乙酸（#64197）、纤连蛋白（#33010018）、胶原蛋白（#A1064401）、雷洛昔芬（#R1402）和多聚甲醛均购自Sigma-Aldrich。手术材料包括20号缝合针、不可吸收缝线、剪刀、移液器和10号手术刀片（印度lotus）。其他材料和试剂包括碘伏（聚维酮碘，10% w/v）、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸钾

VML重建与优化

使用手术刀片在外侧胫前肌上手术创建VML损伤，造成约5 毫米的全层缺损（图1）。从每只大鼠的外侧胫前肌中切除了约56 毫克的肌肉组织。根据Wu等人（2012）提出的标准公式[7]，切除了约50%的肌肉质量。切除组织的质量相当于外侧胫前肌质量的约14%。支架被

讨论

近年来，已测试了多种组织工程（TE）策略以促进VML后的骨骼肌修复。这些方法可以支持受损肌肉组织的部分再生。然而，开发能够有效促进卫星肌肉细胞增殖和分化的功能性支架仍然是一个挑战[21]。由于损伤与VML相关的

结论

本研究表明，含有胶原蛋白、纤连蛋白和雷洛昔芬的RSM优化支架可能促进VML损伤的修复。该支架激活STAT3和MyoD，促进卫星细胞增殖和分化。它还提供了支持卫星细胞生长的环境，并刺激其激活，从而改善肌肉纤维修复和再生。长期毒性研究表明无不良反应，突显了支架的生物相容性。

缩写

VML 容积性肌肉损失

ECM 细胞外基质

MSCs 间充质干细胞

RSM 响应面法

H&E 苏木精-伊红染色

IL-6 白介素-6

STAT3 信号转导与转录激活因子3

MyoD 肌源性分化蛋白1

PAX7 成对盒蛋白7

NC 阴性对照

MCH 平均红细胞血红蛋白量

WBC 白细胞

MCHC 平均红细胞血红蛋白浓度

MCV 平均红细胞体积

HCT 血细胞比容

HGB 血红蛋白

RBC 红细胞

PLT 血小板计数

作者贡献

Subodh Kumar和Yogesh Kumar Verma构思并撰写了本文。Subodh Kumar和Venkatesh Anand Iyer完成了实验。

数据和代码可用性

不适用

文章中的临床试验编号

不适用

资金支持

不适用

伦理批准

实验中使用的所有动物均获得INM/IAEC/2019/Ext01/04的批准。

CRediT作者贡献声明

Subodh Kumar：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式分析，数据管理，概念构思。Venkatesh Anand Iyer：方法学。Yogesh Kumar Verma：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，项目管理。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

Subodh Kumar | Venkatesh Anand Iyer | Yogesh Kumar Verma