《International Dairy Journal》：Casein-derived sleep-enhancing peptides prepared via protease-microbial synergy: hydrolysis characteristics, physicochemical properties, structure-activity relationships, and potential molecular mechanisms
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•CPMSH的分子量较低，结构也比CBH更松散。•源自L. casei GL8072的CPMSH能够最佳地促进睡眠。•芳香残基、Gln、Arg、Leu和Pro位于N/C末端或附近，这些都是CSEPs的关键特征。•FYQL、FPQY和WMHQPH能够结合GABAA受体的α1-γ2界
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CPMSH的分子量较低，结构也比CBH更松散。
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源自L. casei GL8072的CPMSH能够最佳地促进睡眠。
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芳香残基、Gln、Arg、Leu和Pro位于N/C末端或附近，这些都是CSEPs的关键特征。
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FYQL、FPQY和WMHQPH能够结合GABAA受体的α1-γ2界面关键位点。
引言
随着社会的快速发展，失眠已成为一个普遍存在的公共卫生问题。统计数据显示，全球有多达30%的人口受到失眠的影响，长期睡眠障碍可能导致焦虑、抑郁、肥胖、高血压甚至死亡（Zhu等人，2024年）。这种病症的药物治疗主要依赖于苯二氮卓类药物，这些药物通过替代抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）与其受体结合，从而增加Cl?通道的开放频率并诱导睡眠。然而，这些药物伴有显著的不良反应、高度的依赖风险，甚至可能导致认知功能障碍（Modesto-Lowe等人，2024年）。近年来，来自各种食物来源的生物活性肽因其在减轻焦虑、调节情绪和神经保护方面的潜在作用而受到科学研究的广泛关注。酪蛋白是牛奶中含量最丰富的蛋白质，具有多样的氨基酸组成和复杂的三维结构，这赋予了它很高的直接营养价值和相当大的功能性潜力（Chen等人，2024年）。考虑到东方国家对酪蛋白副产品的综合利用程度相对较低，从牛奶酪蛋白中开发促进睡眠的肽是一种重要的方法，可以增加乳制品加工副产品的附加值，同时也符合现代健康管理的演变需求（Liu等人，2025年）。
蛋白酶水解是制备生物活性肽最常用的方法。通过比较不同蛋白酶的水解特性，研究人员成功生产出了多种具有促进睡眠、镇静和安眠效果的肽，包括著名的YLGYLEQLLR（Miclo等人，2001年）、YPVEPF（Qian等人，2022年）、DIQK（Lee等人，2024年）和HQGLPQEVLNENLLR（Chen等人，2023年）。这些肽通过多种机制改善睡眠，例如与GABAA受体结合以抑制中枢神经兴奋性，靶向5-HT1A受体以调节单胺类神经递质的水平，或抑制下丘脑中VLPO神经元的动作电位和放电频率。菠萝蛋白酶是一种具有强蛋白质水解活性的植物蛋白酶，已被用于酪蛋白和其他乳蛋白的水解研究中。2025年，Mo等人基于山羊奶酪蛋白的研究表明，通过计算机模拟筛选，菠萝蛋白酶被预测为能够生成高活性睡眠相关肽的候选酶（Mo等人，2025年）。在我们之前的研究中，在特定的水解条件下，酪蛋白菠萝蛋白酶水解物（CBH）也显示出比其他酪蛋白水解物更好的促眠效果。它将小鼠的睡眠时间延长至5318.33±431.98秒，且没有显著的催眠效果，因此安全性更高。
然而，由于蛋白酶的种类及其切割位点的限制，仅依靠蛋白酶水解已无法满足实际开发中对生物活性肽多样性的需求。因此，近年来发酵技术在肽的研究开发中得到了越来越多的应用。这项技术利用了微生物的独特代谢系统——包括细胞壁蛋白酶、肽运输系统和细胞内肽酶——以更温和、更环保的方式提高蛋白质水解物和新型生物活性肽的多样性（Qian, Zheng等人，2024年）。2019年，Fan等人使用Lactobacillus helveticus CICC6024发酵牛奶酪蛋白，从发酵液的细胞内和细胞外部分鉴定出了241种肽，并筛选出了13种具有潜在生物活性的新肽（Fan等人，2019年）。2022年，Zhi等人筛选了五种蛋白酶菌株，并证明了其中四种的安全性，包括Bacillus subtilis CICC 20030（Zhi等人，2022年）。同样在2022年，Huang等人评估了乳酸菌水解酪蛋白并降低其潜在过敏性的能力，发现乳酸菌显著降低了牛奶蛋白的抗原性和潜在过敏性（Huang等人，2022年）。然而，迄今为止，尚未有研究将微生物发酵应用于促进睡眠肽的开发，益生菌复杂的蛋白酶系统继续影响着代谢过程中产生的肽的组成、结构和活性。
因此，本研究结合了蛋白酶水解和发酵的优点。在酪蛋白菠萝蛋白酶水解物（CBH）的基础上，比较了不同益生菌对水解特性、理化性质、结构特征和促睡眠活性影响的差异。结合LC-MS/MS肽鉴定、结构-活性关系建模和分子对接技术，该研究进一步筛选了促进睡眠的肽，并阐明了它们的结构-活性关系和潜在的分子机制。
章节片段
化学物质
酪蛋白（蛋白质含量超过90%）由华凌 dairy有限公司（中国甘肃）提供。菠萝蛋白酶购买自源野生物技术有限公司（中国上海）。Lactiplantibacillus plantarum DNZ-4、Lactiplantibacillus plantarum D6-8、Lacticaseibacillus rhamnosus R1和Lacticaseibacillus casei GL8072保存在东北农业大学乳品科学重点实验室。肽包括Trp-Met-His-Gln-Pro-His（WMHQPH）、Phe-Pro-Gln-Tyr（FPQY）和Phe-Tyr-Gln-Leu（FYQL）
益生菌的蛋白酶活性比较
培养到稳態阶段的益生菌菌株上清液中含有分泌的细胞外蛋白酶，这些蛋白酶反映了菌株的蛋白酶活性。然而，蛋白质水解物溶液系统在营养成分上与传统的MRS培养基有显著差异，它通常只提供氮源，缺乏碳源、脂质、无机盐和维生素等关键生长因子。研究表明，不同的营养条件
结论
本研究比较了不同益生菌菌株发酵后的酪蛋白菠萝蛋白酶水解物（CBH）的进一步水解行为、结构理化性质和促睡眠效果。随后从蛋白酶-微生物协同水解物（CPMSH）中筛选出了促进睡眠的肽（CSEPs），以阐明它们的结构-活性关系和潜在的分子机制。结果表明Lactiplantibacillus plantarum D6-8
CRediT作者贡献声明
Yibo Liu：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。Zifu Zhao：方法论。Jingwen Wang：概念构思。Yiming He：概念构思。Lu Zhang：数据管理。Yike Sun：数据管理。Libo Liu：监督。Guofang Zhang：监督。Peng Du：监督。Jian He：形式分析。Chun Li：资源提供。
利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能构成利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFF1104501-1）、科学技术部的外国专家重点支持计划（东北特别项目）（D20240070）以及智力支持新疆：人才创新扩展计划的资助。
Yibo Liu|Zifu Zhao|Jingwen Wang|Yiming He|Lu Zhang|Yike Sun|Libo Liu|Guofang Zhang|Peng Du|Jian He|Chun Li
