《International Dairy Journal》：The distinctive bacterial microbiome of traditionally produced Armenian Chechil cheese: insights into the interplay between a recurrent LAB core and the environmental microbiota
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传统亚美尼亚Chechil奶酪是一种以其独特的纤维结构和特定手工生产与成熟实践而闻名的绳状奶酪。本研究首次对传统生产的亚美尼亚Chechil奶酪的细菌微生物组进行了基于扩增子的宏基因组学表征。研究人员分析了四批手工生产批次和一批工业批次，利用16S rRNA基
传统亚美尼亚Chechil奶酪是一种以其独特的纤维结构和特定手工生产与成熟实践而闻名的绳状奶酪。本研究首次对传统生产的亚美尼亚Chechil奶酪的细菌微生物组进行了基于扩增子的宏基因组学表征。研究人员分析了四批手工生产批次和一批工业批次，利用16S rRNA基因V3-V4区域的扩增子测序。结果表明，厚壁菌门（Firmicutes）占主导地位（>97%），其中芽孢杆菌纲（Bacilli）为主要分类单元。三种乳酸菌（LAB）构成了核心微生物群：瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）平均相对丰度最高（42.54%），其次是开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）（23.22%）和乳脂乳球菌（Lactococcus cremoris）（8.58%）。尽管未使用发酵剂，但瑞士乳杆菌的高丰度值得关注，这可能是由反复加热工艺驱动的热选择所致。β-多样性分析显示，来自同一地理区域（久姆里）的样本群落相似性更高。所有五个样本共享52个操作分类单元（OTU），同时存在显著的样本特异性变化（占总丰富度的12–22%），表明存在一个保守的核心微生物群和受当地环境影响的可变组分。基于PICRUSt2的功能预测揭示了广泛的代谢功能一致性，主要包括碳水化合物、氨基酸和脂质代谢途径。该研究得出结论，传统亚美尼亚Chechil奶酪拥有一个由循环乳酸菌核心和环境微生物群共同塑造的独特微生物组，其高丰度的瑞士乳杆菌可能源于特定的生产工艺，并对奶酪的成熟和感官特性有潜在贡献。
研究背景与目的
亚美尼亚Chechil是一种传统的绳状奶酪，以其独特的纤维结构、咸味以及特定的手工生产和成熟工艺而闻名。其传统生产过程不添加商业发酵剂，而是依赖上一批奶酪保留的乳清进行酸化，并通过反复加热、拉伸凝块形成细丝，随后在陶罐中进行约30天的成熟。这种工艺使得奶酪的成熟完全依赖于环境中的微生物群落。尽管这种奶酪具有重要的文化意义和悠久的生产历史，但其微生物多样性，特别是通过不依赖培养的组学方法进行的表征，此前尚属空白。因此，本研究旨在利用基于扩增子的宏基因组学方法，首次系统地描述传统生产的亚美尼亚Chechil奶酪的细菌微生物组，评估其α-和β-多样性，并初步探索这些微生物在成熟过程中的潜在功能作用及其对感官特性的贡献。
研究方法
研究人员于2024年9月从亚美尼亚希拉克州的四个村庄和一个城镇获取了四批手工生产批次和一批工业化生产批次（来自久姆里的“Mega Cheese”公司）的Chechil奶酪样品。所有样品均经过至少30天但不超过60天的成熟。研究人员采用商业试剂盒提取奶酪样品的总DNA，并在华大基因（BGI Genomics）的DNBSEQ-G99平台上，针对16S rRNA基因的V3-V4高变区进行双端（2×300 bp）扩增子测序。原始测序数据经质量控制、引物去除和序列拼接后，以97%的相似度聚类为操作分类单元（OTU），并使用RDP分类器（v2.2）结合Greengenes（v202210）和RDP（Release 19）数据库进行物种注释。α-多样性通过Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数进行评估，β-多样性则通过Bray-Curtis距离和Venn图进行分析。此外，使用PICRUSt2软件基于OTU组成预测了微生物群落的KEGG、COG和MetaCyc代谢通路功能潜力。
研究结果
3.1 测序质量与OTU计数
测序数据显示高质量和高覆盖度（Good's coverage >0.999），所有样品的有效数据利用率均超过99.9%。每个样品的OTU数量在119到178之间，且绝大多数OTU都能成功进行分类学注释。
3.2 分类学注释
在所有样品中，厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度超过97%，而放线菌门（Actinobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）各约占1%。在纲水平上，芽孢杆菌纲（Bacilli）占据绝对优势。在种水平上，瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）的平均相对丰度最高（42.54%），其次为开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）（23.22%）和乳脂乳球菌（Lactococcus cremoris）（8.58%）。值得注意的是，不同样品中的优势菌种存在差异：例如，Streptococcus equinus 在AC5样品中占优，而 Lb. kefiranofaciens 在AC6和AC7中占优，Lb. helveticus 则在AC17和AC18（均来自久姆里）中占优。
3.3 α-多样性分析
α-多样性指数在不同样品间表现出显著差异。观测到的OTU丰富度从AC18的119到AC7的178不等。香农（Shannon）多样性指数范围从AC17的0.70到AC5的1.83，表明群落均匀度存在差异。稀疏曲线和等级丰度曲线进一步证实了样品间在丰富度和均匀度上的差异，其中AC17和AC18显示出更低的多样性和更高的优势菌种集中度。
3.4 β-多样性分析
基于Bray-Curtis距离的分析显示，来自久姆里的两个样品（AC17和AC18）的细菌群落组成最为相似，而AC7则呈现出最独特的群落特征。维恩图（Venn diagram）分析发现，所有五个样品共享52个OTU，而每个样品独有的OTU数量在17到39之间，占总观测丰富度的12%到22%。
3.5 功能预测分析
物种共现网络分析显示，主要的循环乳酸菌（LAB）之间主要呈正相关关系，如 Lc. cremoris, Lt. kefiri, Lb. kefiranofaciens, Strep. thermophilus 和 Lb. helveticus。PICRUSt2的功能预测表明，尽管分类学组成存在差异，但所有样品的预测功能谱高度相似，主要集中在碳水化合物、氨基酸、脂质、核苷酸及辅因子和维生素的代谢，以及能量代谢和膜转运等功能上，体现了功能冗余性。
讨论与结论
讨论部分指出，Chechil奶酪的微生物组以厚壁菌门（主要是乳酸菌）为主导，这与许多巴氏杀菌奶制作的奶酪相似。然而，在不使用发酵剂的传统奶酪中，瑞士乳杆菌（Lb. helveticus）能达到如此高的丰度（42.54%）是非常罕见的，这使其成为首个被报道的此类奶酪。研究人员认为，这可能与Chechil独特的反复加热工艺有关，该工艺对耐热的瑞士乳杆菌形成了选择性优势。瑞士乳杆菌强大的蛋白水解系统可能在Chechil的成熟和风味形成中发挥关键作用。其他主要的乳酸菌，如开菲尔乳杆菌（Lb. kefiranofaciens）和乳脂乳球菌（Lc. cremoris），也因其产胞外多糖、蛋白水解等潜在功能而被讨论。此外，一些低丰度但普遍存在的环境细菌（如 Staphylococcus equorum, Enterococcus faecium 及某些γ-变形菌）的存在，揭示了生产环境和后续处理对最终微生物群落的贡献。
研究结论： 本研究首次全面分析了传统亚美尼亚Chechil奶酪的细菌微生物组，揭示了其由一个稳定的乳酸菌核心（主要由瑞士乳杆菌、开菲尔乳杆菌和乳脂乳球菌组成）和受当地环境影响的多样化微生物群共同构成的特征。这一独特的微生物组结构是其特殊的无发酵剂生产工艺与周围环境微生物相互作用的结果。其中，瑞士乳杆菌的异常高丰度尤为突出，预示着其在奶酪成熟和感官特性发展中扮演着重要角色。这项研究不仅记录了这种传统发酵食品的微生物遗产，也为分离和挖掘具有技术或功能潜力的本土菌株奠定了基础。
