奇异变形杆菌中PER型超广谱β-内酰胺酶的基因组流行病学与耐药机制研究

《International Journal of Infectious Diseases》：Genomic Epidemiology and Resistance Mechanisms of PER-Type Extended-Spectrum β-Lactamases in Proteus mirabilis

　　

：奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）是摩根菌科（Morganellaceae）成员，广泛分布于土壤、水、污水以及人类和动物胃肠道中，是复杂性尿路感染、导管相关感染、伤口感染和血流感染的常见病原体，尤其多见于老年或合并多种基础疾病的患者。PER型超广谱β-内酰胺酶（PER-type extended-spectrum β-lactamases）属于Ambler A类β-内酰胺酶。截至2026年9月9日，NCBI AMRFinderPlus参考基因目录（2026-08-07.1版）收录了18个已命名的blaPER等位基因（blaPER-1至blaPER-18）。PER酶可水解青霉素类、超广谱头孢菌素类和氨曲南，但对阿维巴坦、他唑巴坦或舒巴坦的抑制敏感性因等位基因而异。研究人员对上海瑞金医院2023年1月至2025年3月间收集的118株连续非重复奇异变形杆菌分离株进行筛查，其中17株携带blaPER基因（14.4%；95% CI，9.2%–22.0%），包括6株blaPER-1、9株blaPER-13和2株blaPER-4。blaPER-13是所选临床菌株中最常见的等位基因。所有blaPER基因座均位于ISCR1相关的复杂1类整合子中。两株blaPER-4阳性菌株携带的275,157 bp质粒与公开的ST135菌株质粒CP196196.1完全一致，表明同一质粒存在于三种不同的遗传谱系中。在匹配的遗传背景下，将Ambler S130T突变引入blaPER-1构建体后，头孢他啶-阿维巴坦（CZA）、头孢洛扎-他唑巴坦（C/T）和氨曲南-阿维巴坦（AZA）的最低抑菌浓度（MIC）均达到blaPER-4构建体水平，证实Ambler S130T可重现PER-4的耐药表型。长读长测序分析揭示了共识组装中未能体现的串联耐药阵列。研究人员结合全基因组系统发育分析、blaPER遗传平台比较、匹配背景下的Ambler S130T和Ambler T216S定点突变、转录本测量、蛋白质结构比较以及原始长读长分析，系统研究了克隆背景、移动遗传元件和酶序列变异如何共同影响blaPER的持续存在及其相关耐药表型。

论文解读文章

一、研究背景与研究目的

奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）是肠杆菌目（Enterobacterales）摩根菌科（Morganellaceae）的成员，广泛分布于土壤、水体、污水以及人类和动物的胃肠道中，是复杂性尿路感染、导管相关感染、伤口感染和血流感染的常见病原体，尤其多见于老年或医疗情况复杂的患者。由于奇异变形杆菌对呋喃妥因和四环素具有固有耐药性，且可通过水平基因转移获得额外的耐药决定因子，其临床治疗往往较为困难。

PER型超广谱β-内酰胺酶（PER-type extended-spectrum β-lactamases）属于Ambler A类β-内酰胺酶。截至2026年9月9日，NCBI AMRFinderPlus参考基因目录（版本2026-08-07.1）共收录18个已命名的bla_PER等位基因，即bla_PER-1至bla_PER-18。PER酶能够水解青霉素类、超广谱头孢菌素类和氨曲南，但对阿维巴坦、他唑巴坦或舒巴坦的抑制敏感性因等位基因不同而存在差异。已有证据表明PER酶与头孢地尔（cefiderocol）敏感性降低相关，其中以产PER-1的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）最为显著，但即使在特定宿主背景下，仅凭bla_PER的存在也不足以预测头孢地尔的MIC值。碳青霉烯酶、通透性改变、外排泵、靶点改变、酶过量产生以及其他耐抑制剂型A类酶均可降低新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂的活性。

Guo等人近期报道了在中国多中心奇异变形杆菌菌株中PER-4相关氨曲南-阿维巴坦（AZA）及相关药物的耐药性。在此背景下，研究人员对某三级医院收集的bla_PER阳性奇异变形杆菌进行了系统表征，其中包括携带PER-13的菌株。研究结合全基因组系统发育分析、bla_PER遗传平台比较、匹配背景下的Ambler S130T和Ambler T216S定点突变、转录本测量、蛋白质结构比较以及原始长读长分析，旨在阐明克隆背景、移动遗传元件和酶序列变异如何共同影响bla_PER的持续存在及其相关耐药表型。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员纳入2023年1月至2025年3月期间在上海瑞金医院收集的118株连续、非重复奇异变形杆菌临床分离株。所有菌株均经VITEK 2 Compact自动化鉴定和药敏系统进行常规药敏筛查，以头孢他啶耐药作为富集标准，随后通过MALDI-TOF MS确认菌种鉴定。采用PCR方法筛查bla_PER基因，最终仅对17株PCR阳性菌株进行全基因组测序。

研究采用的主要技术方法包括：肉汤微量稀释法测定19种抗菌药物的MIC值；将各bla_PER编码序列及其天然上游区域克隆至低拷贝载体pACYC184并导入E. coli DH5α；利用商业定点突变试剂盒在匹配背景下引入Ambler S130T和Ambler T216S突变；对17株bla_PER阳性菌株进行双端150 bp短读长和Oxford Nanopore长读长测序，采用Unicycler进行混合组装；利用Prodigal预测编码序列，ResFinder 4.1鉴定耐药基因，MLST 2.1确定序列分型（ST），PlasmidFinder筛查质粒不相容群，ISfinder注释插入序列，IntegronFinder识别复杂1类整合子；对X2074、X2208、X2246和X883的原始长读长进行独立重分析以解析串联结构；采用RT-qPCR测量17株临床菌株和3个重组E. coli DH5α构建体的bla_PER转录本丰度；以PER-1晶体结构（PDB 1E25）为模板构建PER-4同源模型并进行结构比较；从NCBI Pathogen Detection检索34个bla_PER阳性奇异变形杆菌基因组，以X881染色体为参考进行核心基因组比对，经Gubbins掩蔽重组区域后，采用IQ-TREE在GTR+F+ASC模型下推断最大似然系统发育树。

三、研究结果

（一）细菌分离株与抗菌药物敏感性

118株头孢他啶耐药分离株中有17株携带bla_PER（14.4%；95% CI，9.2%–22.0%）：6株携带bla_PER-1，9株携带bla_PER-13，2株携带bla_PER-4。所有17株菌均对氨苄西林、头孢呋辛、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、磺胺甲噁唑-甲氧苄啶和环丙沙星耐药。两株bla_PER-4阳性菌株对头孢他啶-阿维巴坦（CZA）、头孢洛扎-他唑巴坦（C/T）和氨曲南-阿维巴坦（AZA）均呈现高MIC值。X2195同时携带bla_NDM-1，对CZA和C/T耐药，亚胺培南-雷利巴坦（I/R）MIC为8 μg/mL。

（二）临床特征

患者中位年龄为78岁（范围53–99岁），17例患者中16例年龄≥65岁。7株菌来自呼吸道标本，6株来自慢性伤口或皮肤软组织标本，2株来自血液，2株来自尿液或导管相关标本。13例患者有全身性抗菌治疗记录，其中8例曾暴露于碳青霉烯类药物。12例患者好转或出院，1例死亡，1例预后不良，3例预后信息不完整。

（三）分子流行病学与系统发育关系

大多数bla_PER基因（14/17）位于染色体上；质粒携带见于1株bla_PER-1菌株和2株bla_PER-4菌株。MLST将14株菌归入ST135，2株归入ST446，1株归入ST187。掩蔽重组区域后，X2198和X1473相差5个核心基因组SNP，X1226和X2246相差9个。重组过滤后的系统发育树包含51个基因组：17个研究菌株和34个GenBank基因组，后者主要来自中国（n=33）、美国（n=15）、韩国（n=2）和澳大利亚（n=1）。ST135（n=20）、ST641（n=10）和ST327（n=6）是该数据集中最常见的序列型。所有9株bla_PER-13阳性菌株均来自中国且属于ST135。bla_PER-4出现在ST135、ST145、ST187、ST207、ST218、ST332和ST446中，不局限于单一谱系。

（四）bla_PER遗传平台与bla_PER-4质粒比较

所有bla_PER变异体均位于IS_CR1相关的复杂1类整合子中，具有共同的组织结构，包括intI1、可变区、第一个3′保守区段、IS_CR1/orf513、含bla_PER的区域和第二个3′保守区段。X2107和X2398的完整bla_PER-4质粒与公开质粒CP196196.1均为275,157 bp，三者标准化后两两比较显示100%核苷酸一致性和100%双向覆盖率。这三个完全一致的质粒序列分别出现在ST446、ST187和ST135宿主中。

（五）匹配背景下的克隆与定点突变

携带bla_PER-1、bla_PER-13和bla_PER-4的构建体将头孢地尔MIC分别提高至0.125、0.25和0.25 μg/mL，而亲本E. coli DH5α为<0.032 μg/mL。CZA MIC分别为1/4、2/4和>128/4 μg/mL；C/T MIC分别为0.25、0.38和>256 μg/mL；AZA MIC分别为≤0.064、0.25和16 μg/mL。将Ambler S130T引入bla_PER-1后，三种复方制剂的MIC均升至bla_PER-4构建体水平。相比之下，bla_PER-1 Ambler T216S构建体产生的MIC模式与bla_PER-13构建体一致，未出现bla_PER-4相关的高水平耐药。

（六）bla_PER转录本丰度

探索性比较未检测到携带bla_PER-1、bla_PER-13或bla_PER-4的临床菌株之间相对PER转录本丰度存在统计学显著差异（置换Kruskal-Wallis检验，P=0.930）。中位相对值分别为0.271、0.410和0.353。三个DH5α构建体中均检测到bla_PER转录本，但仅含技术重复，未进行推断性统计比较。

（七）蛋白质结构比较

实验PER-1结构与PER-4同源模型的叠合显示整体折叠保守，Ambler S130T位于活性位点附近。PER-1中Ambler残基130与Ambler Ser70羟基的距离为3.2 ?，PER-4中为5.1 ?；与Ambler Lys234的距离在两个结构中均约为2.9 ?；与Ambler Thr235的距离从4.7 ?变为3.9 ?。PER-1和PER-13氨基酸序列一致性为99.7%，唯一差异为Ambler T216S（前体序列中T221S）。

（八）长读长解析的耐药区域异质性

在预设85%一致性阈值下，X2074中分别有320、106和47条读段跨越至少一个、两个和三个完整的8,883 bp IS_CR1相关bla_PER-13模块拷贝，最长代表性读段跨越六个完整单元。X2246中，连续IS_CR1/orf513样锚点定义了约8,980 bp含bla_PER-1的模块和7,212 bp不含bla_PER-1的模块。X883中179条读段包含至少一个完整拷贝的约3,317 bp IS₂₆相关fosA货物单元，两条独立读段支持三拷贝阵列。X2208中77条读段包含至少一个完整拷贝的约12,399 bp IS₂₆相关多药耐药单元。四个菌株均未获得同时满足环状连接和空供体位点标准的读段证据。

四、讨论与结论

讨论部分指出，bla_PER-13是所选头孢他啶耐药菌株中最常见的等位基因，主要出现在ST135中，而携带bla_PER-4的菌株对多种新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂表现出显著耐药。所有bla_PER基因座均位于IS_CR1相关的复杂1类整合子中，但基因组位置和传播背景不同。bla_PER-1和bla_PER-13主要位于染色体上，而两株bla_PER-4菌株均携带高度保守的质粒。染色体系统发育、完整质粒比较和原始长读长分析共同表明，bla_PER的持续存在和传播可能涉及克隆扩增、跨谱系质粒携带和耐药区域局部重塑的组合机制。

匹配遗传背景下的实验表明，Ambler S130T足以重现bla_PER-4构建体对新型抑制剂复方制剂的MIC谱，将这一取代引入bla_PER-1后CZA、C/T和AZA的MIC均升至bla_PER-4构建体水平。bla_PER-1 Ambler T216S构建体重现了bla_PER-13构建体的MIC谱，但未产生bla_PER-4样表型。结构比较将Ambler残基130定位于催化中心附近，但基于无配体结构，不能证明Ambler S130T诱导特定构象变化。bla_PER-13阳性临床菌株的头孢地尔MIC高于无bla_NDM-1的bla_PER-1阳性菌株，但匹配重组构建体仅显示头孢地尔MIC适度升高，临床模式不能仅归因于bla_PER-13。原始长读长揭示了共识组装中未完全呈现的耐药区域异质性，X2074含有两个高阶IS_CR1相关串联阵列，X2246中约7.2 kb的IS_CR1相关串联重复单元不含bla_PER-1，表明IS_CR1相关区域的串联扩增不一定共扩增相邻的bla_PER基因。染色体系统发育和完整质粒比较指向bla_PER传播的多条途径，275,157 bp的bla_PER-4质粒在不同克隆背景中出现，支持跨谱系质粒携带，但仅凭序列一致性不能确立菌株间的直接传播。

研究结论为：bla_PER-13是所选头孢他啶耐药菌株中最常见的等位基因。bla_PER-4对多种新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂赋予最高MIC值，匹配突变实验支持Ambler S130T是该表型的主要决定因素；探索性转录本测量未显示PER转录本丰度显著升高，但不能排除生物学变异。相同bla_PER-4质粒出现在不同ST中，加上谱系相关的染色体bla_PER背景和异质性IS_CR1及IS₂₆相关阵列，表明克隆扩增、质粒传播和局部结构变异共同塑造了奇异变形杆菌中bla_PER的持续存在和耐药性。