《Journal of Huntington's Disease》：iPSC neurodegenerative disease initiative isogenic CAG repeat iPSC line for Huntington's disease
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研究目的：在KOLF2.1J背景中生成表达HTT蛋白内21、56和79个谷氨酰胺重复的诱导多能干细胞（iPSC）系，以及HTT纯合敲除（KO）系，作为iPSC神经退行性疾病计划（iPSC Neurodegenerative Disease Initiative
研究目的：在KOLF2.1J背景中生成表达HTT蛋白内21、56和79个谷氨酰胺重复的诱导多能干细胞（iPSC）系，以及HTT纯合敲除（KO）系，作为iPSC神经退行性疾病计划（iPSC Neurodegenerative Disease Initiative，iNDI）资源库中的附加疾病系列。主要发现：所有iPSC，即使表达79Q长重复或HTT KO，均能使用已建立方案分化为纹状体和皮层神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞。研究人员描述了每次分化的常规质量控制染色和形态学分析。研究人员对分化细胞进行了选定检测；表达扩增重复的星形胶质细胞显示星形胶质细胞蛋白标志物表达和形态特征改变，纹状体神经元显示DARPP-32/CTIP2共定位改变。对纹状体神经元进行的mRNA测序（mRNAseq）显示，与未扩增重复相比，79Q和KO系之间基因表达变化高度相似。结论：KOLF2.1J同源CAG重复系列可作为研究亨廷顿病（HD）机制的社区资源，并具有通过iNDI资源库与其他神经退行性疾病进行直接比较的潜力。
研究背景：亨廷顿病（HD）是遗传性神经退行性疾病，表现为运动、精神和认知症状，由亨廷顿基因（HTT）第一外显子CAG重复扩增引起。CAG长度部分解释症状发病年龄，错配修复通路等修饰基因也显著贡献。HTT广泛表达，但纹状体和皮层组织最受影响，中型多棘神经元（MSN）尤其易损。iPSC可在患者来源内源背景研究CAG扩增，但患者间遗传背景差异影响结果，难以将HD与对照差异归因于突变，除非使用大量细胞系。基因组编辑已创建人类同源iPSC，包括基因修正HD系或向对照HTT位点引入扩增CAG。已有RUES2雌性胚胎干细胞系列（45Q、50Q、58Q、67Q、74Q及HTT纯合/杂合KO）和IsoHD系列（30Q、45Q、65Q、81Q），但均在不同遗传背景生成，不能直接与其他神经退行性疾病突变比较。iNDI是协作项目，用CRISPR/Cas9在对照KOLF2.1J iPSC中引入100多种神经退行性疾病相关变异，创建资源库。本研究在此背景下生成HTT CAG等位系列和纯合KO，作为iNDI附加疾病系列。
研究人员生成KOLF2.1J背景的21Q、56Q、79Q HTT iPSC系及纯合HTT KO系，分化为纹状体和皮层神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。所有iPSC可分化为目标细胞。KO iPSC仅评估向纹状体神经元分化，也成功。研究人员观察到CAG重复长度依赖的GLAST表达和星形胶质细胞形态改变，以及KO纹状体神经元DARPP-32/CTIP2共定位改变。小胶质细胞和皮层神经元在检测中未显示明显功能差异，PSD95/SYP突触共染色无变化。纹状体转录组分析显示79Q和HTT KO系基因表达差异最显著，涉及CREB信号、细胞黏附、cAMP介导信号等通路。该系列可作为社区资源研究HD机制并跨疾病比较。
关键技术方法：研究人员在iNDI参考KOLF2.1J iPSC中，用CRISPR/Cas9两步等位特异性编辑生成HTT CAG等位系列，并用Cas9/sgRNA和供体切除HTT编码区及外显子6获得纯合KO。用Sanger测序、纳米孔测序、Western blot、qPCR、SNP array和aCGH验证重复长度、蛋白表达、多能性和基因组完整性。采用NGN2过表达分化皮层神经元，按已建立方案分化星形胶质细胞、小胶质细胞和纹状体神经元。用免疫细胞化学、共聚焦成像、Imaris形态和共定位分析、pHrodo S. aureus吞噬实验、mRNA测序、DESeq2和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析。样本来源为KOLF2.1J参考细胞系，扩增重复供体来自iPSC系CS03iHD-53n3及Addgene质粒pJOP-HTT-HR81Q（#92250，由Mahmoud Pouladi保存）。
研究结果：Generation of a HTT CAG allelic series in iPSCs。研究人员用两步编辑，先引入杂合3 bp缺失，再用sgRNA2靶向缺失等位基因，插入19CAG-CAA-CAG（21Q）、54CAG-CAA-CAG（56Q）、77CAG-CAA-CAG（79Q）。Sanger和纳米孔测序确认重复，Western blot确认HTT和mHTT表达，qPCR确认多能性，SNP分析确认核型。NGN2 mediated cortical neurons。将21Q、56Q、79Q iPSC转染可诱导PB-TO-hNGN2，分化28天。各系高比例MAP2阳性成熟神经元，80–95%核为NEUN阳性，约80%表达层VI皮层标志TBR1，表明可分化为NGN2介导皮层神经元。79Q iAstrocytes characteristics suggest dysfunctional astrocytic properties and morphology。iAstrocytes表达GLAST、GFAP、SOX9。56Q和79Q GLAST降低，SOX9荧光强度略降；79Q总纤维长度和Sholl交叉数减少，56Q稍降。仅1个生物学重复，统计未进行，解释为趋势。No phagocytic changes in iMG with expanded repeats。iMG表达IBA1、PU.1、P2RY12、CX3CR1。pHrodo标记S. aureus吞噬实验显示21Q、56Q、79Q在12、18、24小时荧光显著增加，各重复长度间无显著可重复差异。HTT isogenic and KO lines can differentiate into neurons enriched for striatal neurons。生成纯合KO，HTTKO_1和HTTKO_2无HTT蛋白，保持多能性和核型正常。21Q、56Q、79Q、HTTKO_1、HTTKO_2分化37天为MSN富集神经元，70–90% NEUN阳性，高MAP2和FOXP1；DARPP-32
+/CTIP2
+共表达35–60%，扩增系略增，KO略降，HTTKO_2与56Q和79Q显著不同；未观察到体细胞重复不稳定；SYP/PSD95共定位无显著差异。HTT KO lines display similar deficits as long CAG repeats。mRNAseq显示各系重复聚集，按基因型与21Q分离。56Q vs 21Q有96个差异表达基因（DEG），79Q vs 21Q有389个，HTTKO vs 21Q有1441个，重叠少。IPA显示CREB信号、G蛋白偶联受体信号、黏着斑激酶（FAK）信号等通路失调。79Q与KO在通路水平更相似，56Q影响相似通路但多数方向相反。
讨论与结论：研究人员认为该KOLF2.1J同源系列是社区资源，可用于HD机制研究并与iNDI其他神经退行性疾病突变直接比较。所有系成功分化为目标细胞，选定检测中iMG基础功能无差异，iAstrocytes和MSN富集神经元有细微表型改变。79Q iAstrocytes GLAST和形态异常类似HD患者来源iAstrocytes，可能反映谷氨酸摄取受损或成熟不足，需进一步分析。56Q和79Q iMG未显示标志物或吞噬功能受损；HD小胶质细胞可能影响更细微或与其他细胞互作。HTTKO_2 DARPP-32/CTIP2共定位减少，支持HTT在神经元发育中的重要作用。mRNAseq显示56Q、79Q、KO影响相同通路但基因表达模式不同，某些方向相反。79Q与KO更相似，提示部分CAG扩增相关失调可能是HTT功能丧失后果。56Q可能与早期通路失调有关，79Q可能更严重HTT功能丧失。该系列可与iNDI中阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化（ALS）等模型比较。研究结论翻译：KOLF2.1J同源CAG重复系列可作为研究HD机制的社区资源，并具有通过iNDI集合与其他神经退行性疾病进行直接比较的潜力。
