基于三七细胞外囊泡样纳米囊泡递送P110肽治疗脑出血的工程化策略研究

《Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids》：Engineered Panax notoginseng nanovesicles enhance peptide delivery in intracerebral hemorrhage

　　

目的： 脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）的肽类治疗药物常因全身给药后快速降解和脑内暴露不足而受限。本研究旨在评估三七（Panax notoginseng）来源的细胞外囊泡样纳米囊泡（Pn-EVs）能否作为载体，改善线粒体分裂抑制剂P110在实验性ICH中的递送效率及治疗效果。 方法： 研究人员通过差速超速离心法从三七中分离获得Pn-EVs，并采用超声处理将P110装载于Pn-EVs上，制备得到Pn-EVs@P110。研究评估了其装载效率、稳定性及体外释放行为；通过胶原酶诱导的ICH小鼠模型中的荧光成像评估其体内分布；并分析神经功能、血肿体积、脑水肿、神经元损伤、小胶质细胞活化、炎症反应、氧化应激、线粒体动力学相关蛋白以及转录组学和代谢组学变化，以评价治疗效果及潜在机制。 结果： Pn-EVs@P110的装载效率超过80%，理化性质稳定，并能在体外持续释放P110。荧光成像显示，静脉给药后囊泡相关信号在损伤脑组织中蓄积。与游离P110相比，Pn-EVs@P110显著改善了ICH小鼠的神经功能结局，减少了血肿体积和脑水肿，并减轻了神经元丢失。这些效应与小胶质细胞活化减弱、促炎细胞因子和氧化应激标志物水平降低，以及线粒体动力学相关改变的恢复有关。多组学分析进一步表明其调节了炎症和线粒体相关通路。 结论： Pn-EVs可作为生物源性递送平台，增强P110在实验性ICH中的治疗效果。这些发现支持植物来源细胞外囊泡样纳米囊泡作为神经系统疾病肽类递送载体的潜在应用。

论文解读：基于三七细胞外囊泡样纳米囊泡递送P110肽治疗脑出血的工程化策略

一、研究背景与科学问题

脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是出血性卒中中致死率极高、致残严重的亚型，目前有效的药物治疗手段极为有限。ICH后继发性脑损伤的核心病理机制包括过度神经炎症、氧化应激、代谢紊乱及线粒体功能障碍，尤其以活化的小胶质细胞中线粒体损伤最为突出。近年研究指出，线粒体动力学失调是连接线粒体功能障碍与炎症放大效应的关键病理环节，其中动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1, Drp1）与线粒体分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1, Fis1）的异常相互作用导致线粒体过度分裂，进而促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成及促炎性小胶质细胞活化。P110是一种选择性肽类抑制剂，可干扰病理性的Drp1-Fis1相互作用，同时基本保留生理性线粒体动力学，已在多种实验性神经系统疾病中显示出神经保护潜力。然而，作为肽类药物，P110在全身给药后易被酶降解、系统性清除迅速，且在损伤脑组织中蓄积有限，严重制约其疗效。因此，开发能够提高肽类药物稳定性、脑内暴露量及治疗持续时间的递送策略，是推动P110用于ICH治疗转化的关键前提。

二、研究内容与核心结论

针对上述瓶颈，本研究创新性地将三七（Panax notoginseng）来源的细胞外囊泡样纳米囊泡（Pn-EVs）作为递送平台，通过超声辅助装载策略将P110封装于Pn-EVs中，构建了Pn-EVs@P110复合递送系统，并在胶原酶诱导的ICH小鼠模型中系统评估其递送效率与治疗效果。研究结果表明，Pn-EVs@P110装载效率超过80%，理化性质稳定，并呈现持续释放特征；静脉给药后能够高效蓄积于损伤脑组织，并被小胶质细胞摄取。与游离P110相比，Pn-EVs@P110显著改善神经功能、缩小血肿体积、减轻脑水肿及神经元损伤，同时抑制小胶质细胞活化、降低促炎细胞因子和氧化应激水平，并恢复线粒体动力学相关蛋白表达及线粒体形态与功能。转录组学和代谢组学分析进一步揭示其调节炎症和线粒体能量代谢相关通路。该研究证实了植物来源细胞外囊泡样纳米囊泡作为肽类递送平台在神经系统疾病中的可行性，为工程化药用植物囊泡的转化应用提供了实验依据。

三、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：1）差速离心联合超速离心法从三七新鲜根中分离纯化Pn-EVs；2）超声辅助装载策略制备Pn-EVs@P110；3）透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）表征囊泡形态、粒径及浓度；4）超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）进行植物化学物谱分析；5）高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）测定装载效率及体外释放行为；6）活体荧光成像（IVIS）及共聚焦显微镜评估体内分布和细胞摄取；7）转录组学（Illumina NovaSeq 6000测序）和代谢组学（UHPLC-Q Exactive Plus Orbitrap质谱）多组学分析；8）免疫组化/免疫荧光、Western blot、qRT-PCR、ELISA及JC-1探针等评估神经炎症、氧化应激及线粒体功能。动物实验采用雄性C57BL/6小鼠（6周龄，20-25 g，购自济南朋悦实验动物中心），通过胶原酶VII-S右侧纹状体注射建立ICH模型，并经动物伦理委员会批准（批准号：JNRM-2025-DW-140）。

四、研究结果

（一）Pn-EVs及Pn-EVs@P110的制备与表征

研究人员通过差速超速离心从三七根中成功分离出具有典型囊泡杯状形态的Pn-EVs，UPLC-HRMS检测到人参皂苷Rg1、人参皂苷F5、绞股蓝皂苷XVII及人参皂苷Rb1等代表性三七源人参皂苷。P110装载后，Pn-EVs@P110保持结构完整且无明显聚集，粒径约150 nm，装载后略有增大；HPLC测定装载效率为80.1% ± 5.2%；4 °C储存6天粒径保持稳定；体外释放呈持续模式，72 h释放约60%。

（二）Pn-EVs@P110的体内分布与小胶质细胞摄取

活体荧光成像显示，静脉注射DiR标记的Pn-EVs@P110后，颅脑区域荧光信号在1至12 h内进行性增强，而游离DiR在颅脑区域信号显著较弱；离体器官成像进一步证实脑内可检测到荧光信号，同时肝、脾亦有分布。共聚焦显微镜显示，囊泡相关荧光与损伤脑组织中的Iba-1阳性小胶质细胞明显共定位；体外实验证实BV2小胶质细胞对Pn-EVs@P110呈时间依赖性摄取，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激组在3 h时摄取显著高于对照组。

（三）Pn-EVs@P110改善ICH后神经功能并减轻脑损伤

在胶原酶诱导的ICH小鼠模型中，与未治疗ICH组相比，Pn-EVs@P110显著降低改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score, mNSS）、缩小血肿体积、降低脑含水量。H&E染色显示Pn-EVs@P110明显减轻血肿周围区神经元变性和组织紊乱；NeuN免疫荧光显示神经元存活增加；TUNEL染色显示凋亡细胞显著减少。体外CCK-8实验进一步证实Pn-EVs和Pn-EVs@P110在测试浓度下无细胞毒性，并能显著改善HT22神经元在氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）损伤后的存活率，而游离P110在相同给药条件下改善有限。

（四）转录组学与代谢组学揭示炎症和线粒体相关通路调节

转录组学主成分分析显示ICH、Pn-EVs和Pn-EVs@P110各组间呈明显聚类分离；Pn-EVs@P110逆转了大部分ICH相关转录变化，部分恢复ATP8、Tufm、Tomm40l等线粒体相关基因表达。KEGG富集分析显示差异表达基因主要集中于炎症和免疫应答相关通路，包括TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用及趋化因子信号通路；基因集富集分析进一步显示固有免疫应答被抑制，线粒体ATP合成相关基因集得到富集。代谢组学分析显示差异代谢物主要涉及能量代谢、氧化磷酸化和脂质代谢等通路。

（五）Pn-EVs@P110抑制小胶质细胞活化、神经炎症及氧化应激

免疫组化和免疫荧光分析显示，ICH后血肿周围区Iba-1阳性细胞密度显著增加并呈活化形态；Pn-EVs@P110治疗显著降低小胶质细胞活化，Sholl分析显示小胶质细胞突起复杂度增加、恢复分支形态。qRT-PCR证实血肿周围组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平显著降低。DHE染色显示ROS生成减少，8-OHdG定量显示氧化性DNA损伤得到减轻。

（六）Pn-EVs@P110改善线粒体动力学及线粒体功能

Western blot分析显示，ICH诱导Drp1及磷酸化Drp1（Ser616）显著上调，线粒体融合蛋白MFN2和OPA1表达降低；Pn-EVs@P110治疗显著逆转这些改变，部分恢复线粒体分裂与融合平衡。透射电镜观察LPS刺激的BV2细胞显示严重线粒体碎片化和肿胀，Pn-EVs@P110处理显著保护线粒体超微结构、维持完整嵴结构；定量分析显示线粒体面积和长宽比显著增加。功能方面，Pn-EVs@P110显著改善线粒体膜电位（JC-1红/绿比值）和细胞内ATP水平。

五、讨论与结论

讨论部分指出，Pn-EVs@P110疗效增强可能与其改善P110递送有关，ICH后血脑屏障破坏可能有利于纳米颗粒进入损伤脑组织，Pn-EVs作为保护性载体延长肽类药物可用性并增加损伤部位局部暴露；体外持续释放特征进一步延长治疗活性。除递送改善外，Pn-EVs@P110治疗与多种继发性脑损伤病理过程的调节相关，包括抑制小胶质细胞活化、减轻氧化应激、部分恢复线粒体形态和功能，多组学分析显示炎症相关通路和线粒体能量代谢的协调调节，支持线粒体稳态恢复参与神经保护效应。此外，Pn-EVs单独给药亦表现出中等保护效应，提示囊泡内源性活性成分可能贡献生物学活性，植物来源囊泡可能不仅作为递送载体，还可作为具有生物活性的治疗平台。研究局限性包括：缺乏标准化植物囊泡质量控制标志物、行为学评估局限于急性期72 h、未进行严格药代动力学分析和摩尔等效剂量比较、未进行系统剂量-反应分析、样本量较小、胶原酶模型不能完全模拟自发性ICH、长期安全性和重复给药研究仍需开展。

结论： 总体而言，本研究结果表明，工程化三七来源细胞外囊泡样纳米囊泡可增强肽类递送并提高P110在实验性ICH中的治疗效果。通过整合药剂学表征、多组学分析和机制验证，这些发现支持开发基于植物来源细胞外囊泡的神经系统疾病递送平台，并为进一步探索工程化植物囊泡作为治疗系统提供了框架。