植物来源细胞外囊泡（PDEVs）作为肠-肝通讯中的天然核酸载体：代谢性肝病跨王国调控的证据、争议与转化前景

《Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids》：Plant-derived extracellular vesicles as natural nucleic acid carriers in gut-liver communication: implications for metabolic liver disease

　　

植物来源细胞外囊泡（PDEVs）是由植物细胞释放的纳米级囊泡，含有内源性核酸，包括微小RNA（miRNAs）、小干扰RNA（siRNAs）、转运RNA片段（tRFs）和线粒体DNA（mtDNA）。这些特征使PDEVs作为适合口服递送的天然纳米载体而受到日益关注。PDEV形成已被描述为三种生物发生途径，即多囊体（MVBs）释放、质膜出芽和胞间连丝转运。然而，PDEVs相关核酸能否承受胃肠道消化并随后调节哺乳动物基因表达仍存在争议。此类相互作用通常在跨王国基因调控框架内被考虑。该综述总结了关于PDEVs核酸生物学的当前证据，包括其生物发生、货物多样性和分离方法。随后评估了关于胃肠道稳定性、肠道摄取和向肝脏移动的证据，以及跨王国转移的实验支持及其解释所面临的方法学局限性。PDEVs相关核酸已被提出作为炎症和代谢背景下肠-肝轴信号传导的候选介质，但其因果贡献和囊泡内定位仍未完全明确。该综述还讨论了工程化策略和潜在生物标志物应用。PDEVs介导的核酸转移显示出前景，但需要更严格的方法学标准。标准化分离流程、严格污染控制和因果验证对于确立生物学相关性并支持临床转化是必要的。

INTRODUCTION
植物亦产生囊泡样纳米颗粒。植物来源细胞外囊泡（PDEVs）又称外泌体样纳米颗粒（ELNs）或植物来源纳米囊泡（PDNVs），已从食用植物中分离，其大小和形态类似哺乳动物细胞外囊泡（EVs），并携带多样分子货物。PDEVs安全性较好、免疫原性低；但多数研究关注其作为药物递送载体，而作为跨王国通讯中天然核酸载体的作用研究较少。口服研究提示PDEVs可抵御胃肠消化，并可能将核酸货物运向肠-肝轴和体循环。膳食植物核酸能否功能性调节哺乳动物基因表达仍有争议。膳食核酸可能因囊泡包装或与蛋白、脂蛋白结合而受保护。肠-肝轴为食源PDEVs影响全身代谢和肝病提供了路径。该综述围绕五个问题展开，并区分三个证据层次：全PDEV制剂的生物活性、提示囊泡核酸贡献的间接证据、以及特定核酸负责的因果证据。

PDEVs AS NUCLEIC ACID RESERVOIRS
Biogenesis and subtypes of PDEVs
PDEV形成有三条途径：多囊体（MVBs）与质膜融合释放腔内囊泡；质膜向外出芽生成微囊泡样结构；以及经胞间连丝转运至邻近细胞，这是植物特有途径。多数研究通过差速离心、超速离心或密度梯度离心从果蔬汁分离PDEVs，产物异质，常称PDEVs、ELNs、PDNVs或PDENs。囊泡直径约30-200 nm，透射电镜呈杯状，但杯状可能部分为固定脱水伪影。PDEV富含磷脂酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，但缺乏普遍接受的蛋白标志物。核酸载荷随植物种类、组织、发育阶段和病原感染而变化。多数植物囊泡制备物异质且胞内来源未验证，故除非证实内体生成，不应称为外泌体。

Methodological considerations for nucleic acid profiling in PDEVs
PDEV相关核酸表征依赖分离和分析方法。差速离心和超速离心可能共分离蛋白-RNA复合物、细胞碎片和脂质聚集体。尺寸排阻色谱和切向流过滤纯度更高但植物应用有限。提取条件如pH和澄清步骤可改变PDEVs特征。干燥和醇提可选择性去除热不稳定和两亲性成分，包括miRNAs、蛋白和脂质；新鲜材料囊泡保留天然货物。起始材料重要：少量研究从质外体液体分离，多数用果汁、压榨组织或匀浆，机械破坏可引入细胞内和细胞器物质及非囊泡核酸。因此需区分囊泡内定位与未分级制备物。小RNA测序和总RNA常不能区分囊泡内RNA与囊泡表面RNA。核酸酶抗性不绝对证明囊泡内定位；需膜破坏对照或单囊泡方法。应报告植物种类、组织、分离程序、囊泡特征、RNA提取测序和污染控制。植物多酚和多糖干扰RNA提取和测序，需优化去除策略，并可用A₂₆₀/A₂₃₀和A₂₆₀/A₂₈₀等评估RNA纯度。

Intrinsic nucleic acid cargo: miRNAs and beyond
高通量测序显示PDEV制备物富含小RNA，包括植物miRNAs、小干扰RNAs（siRNAs）、相位小干扰RNAs（phasiRNAs）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）片段，以及mRNA、长链非编码RNA（lncRNAs）、环状RNA和核、线粒体、叶绿体DNA片段。姜、葡萄、葡萄柚、柠檬、西兰花和胡萝卜来源囊泡中检测到植物miRNAs，丰度常与全组织不同。DNA物种应谨慎解释，因可能为细胞器污染。PDEV中核酸可能并非随机，而是选择性富集；但差异共分离、降解和方法变异也可导致组成差异。病原感染下可见胁迫相关小RNA差异装载。PDEV核酸谱可能作为植物分子“条码”，并具生物标志物或工程化治疗潜力。

ORAL DELIVERY AND CROSS-KINGDOM GENE REGULATION OF PDEV NUCLEIC ACIDS
Gastrointestinal stability, uptake, and systemic transport of PDEVs
口服PDEVs须耐胃酸、胆盐和消化酶。姜、葡萄柚和蓝莓来源囊泡在模拟胃/肠液中保持大小和形态；但百合囊泡在模拟肠条件下倾向聚集，提示胃肠稳定性具囊泡和区室特异性。完整囊泡优于机械破碎囊泡。肠腔内PDEVs可被上皮细胞、免疫细胞和肠道微生物内化。姜和葡萄柚ELNs通过内吞和巨胞饮进入上皮细胞；姜ELNs靶向结肠上皮和固有层巨噬细胞，抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体。PDEVs可通过门静脉和淋巴网络到达肝和体循环，但两条途径相对贡献及完整囊泡与降解成分比例仍不清。

Cross-kingdom gene regulation: evidence and controversies
膳食植物miRNAs能否经受消化、进入体循环并功能性调节哺乳动物基因表达仍高度争议。早期报道水稻miR168a在血清中检出并抑制LDLRAP1翻译，但严格喂养研究未能重复，提出交叉杂交和环境污染等技术伪影。公共数据集再分析提示植物miRNA读数可能源于测序错误而非生物摄取。植物miR159、茶EV miRNAs、人参外泌体miRNAs、Polygonatum sibiricum miR166u等被报道具功能，但不同研究证据层次不同。关键不确定性包括膳食miRNA是否达生物相关浓度、完整EV货物如何跨肠上皮、环境污染物混淆痕量检测。可区分三类主张：PDEV制剂在黏膜表面产生生物效应；部分效应可能涉及囊泡核酸；PDEV相关核酸介导远隔组织系统性跨王国基因调控。前两者有增长证据，第三者仍有争议。

FUNCTIONAL RELEVANCE ALONG GUT-LIVER AXIS
Immunomodulatory and anti-inflammatory effects
PDEVs在肠道表现免疫调节和抗炎效应，但囊泡小RNA贡献未完全明确。姜ELNs缓解急慢性结肠炎、促进肠修复并预防结肠炎相关肿瘤发生。黄芩来源囊泡下调程序性死亡配体1（PD-L1）并增加瘤内CD3⁺/CD8⁺ T细胞；芹菜和黄芪来源PDEVs亦调节免疫检查点或肿瘤相关巨噬细胞。这些效应伴随肠道巨噬细胞和上皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β降低，IL-10和IL-22升高及NLRP3抑制。茶EV小RNA osa-miR166d-5p和gma-miR396a-3p经双荧光素酶验证靶向AKT1和IKBKB的3’非翻译区（3’UTRs），减弱AKT/NF-κB信号。黄连miR-5106靶向Slc39a2恢复锌稳态，减少中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。Rosa roxburghii纳米囊泡可再平衡CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞与IL-17⁺CD4⁺ T细胞。但多数研究仍基于货物谱、靶点预测或相关性而非直接因果测试。

Metabolic regulation and protection against MASLD/MASH
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）和MASH是典型肠-肝轴疾病。口服食源PDEVs被肠上皮和免疫细胞摄取，并与肠道菌群互作，改善肠屏障完整性，减少内毒素入门静脉。PDEVs调节肝脂代谢；蓝莓、柑橘和葡萄囊泡小RNA预测靶向CD36、SREBP-1c、FASN、ACC和PPARα/γ，但尚无囊泡递送背景下实验验证。合成miR8126-3p/5p在肝细胞模型下调QKI和MAPKAPK2及脂生成基因，减少脂质积累。蓝莓ELNs缓解饮食诱导脂肪肝；姜ELNs抗酒精性肝损伤；Curcuma wenyujin来源纳米囊泡改善MASH表型。然而肝病研究中无一满足明确核酸依赖标准，因果关系仍开放。

Antifibrotic and tissue-regenerative implications
PDEVs具抗纤维化特性。姜、葡萄和药用植物来源囊泡在实验模型中减轻肝纤维化，减少胶原沉积，下调α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和转化生长因子-β（TGF-β）。还可降低氧化应激和炎症。西洋参ELNs部分通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）介导的铁死亡减轻氧化损伤。蘑菇来源囊泡保护急性肝损伤。PDEVs在肝外组织也显示再生潜力，如皮肤应用和Inula japonica来源ELNs减轻LPS诱导急性肺损伤并恢复肠道微生物稳态，激活AhR-CYP1A1轴。核酸是否贡献这些肝外效应仍待确定。

ENGINEERING STRATEGIES AND APPLICATIONS
Engineering strategies for PDEVs-mediated nucleic acid delivery
工程化PDEVs作为外源货物载体不等于天然膳食PDEVs核酸介导跨王国调控。装载策略包括电穿孔、超声、挤出和转染等分离后方法，以及植物生物工厂策略。葡萄柚脂质纳米载体、针叶樱桃来源ELNs可封装外源miRNA并保护其耐RNase、酸和碱，口服后递送至小肠和肝。PDEVs利于肠肝靶向，可引入表面配体增强靶向；生姜ELNs包被杂合纳米颗粒等。PDEVs优于哺乳动物EVs之处包括农业副产物规模化生产、安全性和口服肠肝靶向，但存在批间变异、缺乏通用标志物、外源核酸装载效率不稳定等限制。

Applications and detection of plant-derived nucleic acids as potential circulating biomarkers
检测血液中植物来源核酸需灵敏特异方法。定量聚合酶链反应（qPCR）和数字聚合酶链反应（dPCR）可定量血浆/血清特定植物miRNA，高通量小RNA测序需严格生物信息过滤。分析前变量影响结果。EV相关核酸富集或提高灵敏度但引入选择偏倚。循环植物核酸可作为膳食生物标志物、治疗指标或药效学指标，但血浆中检出植物核酸不证明完整PDEVs摄取。需标准操作程序（SOPs）和实验室间环试验。在MASLD中，尚无研究同时检测循环PDEV来源miRNA并评估其与脂质谱关系。

Challenges and future directions
方法异质性仍是主要障碍。需统一术语和标准化实验方案，报告植物种类、生长条件、提取方法和囊泡表征。建立PDEVs核酸研究最低信息标准。植物特异性污染物多酚和多糖需定制提取方案，并系统量化其对下游分析影响。需基因“条码”标记、膜破坏对照、单囊泡成像和功能挽救验证。多中心重复和预注册可加强证据。PDEVs可用于精准营养和肠-肝轴治疗，但需与监管要求协调。

CONCLUSION
PDEVs是连接膳食摄入、细胞外囊泡生物学和跨王国核酸通讯的天然纳米载体，肠-肝轴是其重要研究背景。其可食用、低免疫原性、可扩展及内源核酸货物与肠道屏障、肝代谢和炎症效应相关，具MASLD、IBD和肝纤维化治疗潜力。然而当前证据多基于全PDEV制剂生物活性及核酸货物的相关性或预测，特定植物核酸因果证据有限，囊泡内定位和检测方法稳健性仍不确定。未来需标准化表征、因果验证和工程化靶向递送。