《Frontiers in Oncology》：Exploring the potential mechanisms of Pei Yuan Yi Fei decoction for non-small cell lung cancer through network pharmacology and experimental validation
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目的： 尽管培元益肺方（PYYFD）已被证明对非小细胞肺癌（NSCLC）具有治疗作用，但其潜在机制尚未完全阐明。本研究旨在探索PYYFD治疗NSCLC的潜在分子机制。
方法： 研究人员从TCMSP、GeneCards和OMIM数据库获取活性化合物及其靶基因，并
目的： 尽管培元益肺方（PYYFD）已被证明对非小细胞肺癌（NSCLC）具有治疗作用，但其潜在机制尚未完全阐明。本研究旨在探索PYYFD治疗NSCLC的潜在分子机制。
方法： 研究人员从TCMSP、GeneCards和OMIM数据库获取活性化合物及其靶基因，并通过韦恩图（Venn diagram）鉴定这些基因的交集基因。从转录组数据集中鉴定差异表达基因（DEGs），随后将交集基因与DEGs再次取交集以确定候选治疗靶点。基于候选治疗靶点，研究人员进行了单因素Cox回归和LASSO-Cox分析以评估其预后价值，构建了预后风险模型和列线图（nomogram），并在GSE31210和GSE42127中进行了外部验证。利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）表征这些预后基因的细胞类型特异性表达模式。通过分子对接评估潜在的化合物-靶点相互作用。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（western blotting）评估PYYFD处理后PC-9细胞中预后基因的表达，同时利用CCK-8实验评估细胞活力。
结果： 研究人员鉴定了95个候选治疗靶点。LASSO分析确定了8个预后基因：CDC25C、GSTM2、BIRC5、EPHB2、NUF2、COL1A1、ADH1C和ACHE。该预后模型在内部和外部队列中均表现出一定的预测能力（AUC > 0.6）。scRNA-seq分析显示COL1A1在成纤维细胞中特异性高表达。分子对接分析提示COL1A1与槲皮素（quercetin）之间存在计算预测的潜在相互作用，预测结合能约为-9 kcal/mol。RT-qPCR和WB结果显示，PYYFD处理后所有预后基因的表达水平均发生显著变化。CCK-8结果显示PYYFD显著降低了PC-9细胞的活力。
结论： 本研究共鉴定出95个候选治疗靶点，并从候选治疗靶点中确定了8个预后基因（CDC25C、GSTM2、BIRC5、EPHB2、NUF2、COL1A1、ADH1C和ACHE）。
论文解读
一、研究背景与意义
肺癌（LC）是全球癌症负担的重要组成部分，占新发恶性肿瘤的12.4%和癌症相关死亡的18.7%。非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%，通常以肺腺癌或鳞状细胞癌的形式被诊断，具有高复发率和转移率的特点。NSCLC患者5年生存率仅为15%，这归因于诊断延迟和治疗选择有限。目前NSCLC的治疗策略包括手术、化疗、放疗和免疫治疗。尽管EGFR抑制剂等靶向治疗和PD-L1抑制剂等免疫治疗显著改善了患者生存，但仅有不到四分之一的患者对这些治疗产生应答，且毒性和耐药问题限制了其广泛应用。因此，开发低毒性的新型NSCLC治疗药物迫在眉睫。
培元益肺方（PYYFD）是基于金水六君煎和黄芪桂枝五物汤化裁而成的新方剂，依据中医“扶正祛邪”理论，按照益气活血的治疗策略组方，包含当归、黄芪、陈皮、半夏等13味中药。临床实践已证实其抗癌效果，且各单味药的抗NSCLC作用已有实验证据，但PYYFD整体治疗NSCLC的作用机制研究尚不充分。网络药理学作为整合药理学、系统生物学和生物信息学的跨学科研究方法，为系统阐明中药复方疗效的复杂机制提供了可靠工具。同时，高通量测序技术的快速发展使TCGA、GEO等数据库为大规模研究基因表达谱和临床特征提供了丰富资源。然而，现有研究多缺乏实验验证和多组学证据，对中药复方在NSCLC复杂肿瘤微环境（TME）中作用的研究也较少。因此，本研究整合网络药理学、生物信息学、scRNA-seq、分子对接和实验验证，系统探索PYYFD抗NSCLC的活性化合物、候选治疗靶点及潜在机制，并评估这些候选靶点的预后价值，为PYYFD治疗NSCLC提供参考。
二、主要技术方法概述
研究人员从UCSC Xena平台获取肺鳞状细胞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）的RNA-seq数据、临床信息和生存数据，合并为TCGA-NSCLC训练队列（预处理后990个肿瘤样本），以GSE31210（226个肿瘤样本）和GSE42127（176个肿瘤样本）作为独立验证集，以GSE198099作为scRNA-seq数据集（含2个肿瘤和2个配对正常组织样本）。利用TCMSP数据库获取PYYFD的活性化合物和靶基因（OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18，HL ≥ 4），从GeneCards和OMIM获取NSCLC疾病靶点。采用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），通过韦恩图取交集确定候选治疗靶点。使用clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析，利用STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。基于候选靶点进行单因素Cox回归和LASSO-Cox分析构建预后模型，通过Kaplan-Meier生存曲线和时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线评估模型性能。利用Seurat进行scRNA-seq数据分析，Harmony进行批次校正，CellChat推断细胞间通讯网络，Monocle2进行拟时间轨迹分析。采用AutoDock Vina进行分子对接。最后通过RT-qPCR、western blotting和CCK-8实验在PC-9细胞中进行实验验证。
三、研究结果
3.1 差异表达基因的鉴定
对UCSC Xena来源的NSCLC样本进行差异分析，共鉴定出6394个DEGs，其中肿瘤组织中4016个上调、2378个下调（|log2 FC| ≥ 1，adj.p < 0.05）。
3.2 中药-成分-靶点网络的构建
从TCMSP数据库获得111个活性药物成分和256个对应靶点，共获得5912个疾病靶点（GeneCards 5772个、OMIM 192个）。交集分析得到203个交集基因，构建了包含13味中药、111个成分、203个交集基因和1589个相互作用对的网络。
3.3 候选治疗靶点的鉴定与功能分析
将交集基因与DEGs取交集后鉴定出95个候选治疗靶点。GO富集分析显示这些靶点显著参与脂多糖（LPS）、细菌分子、外源物、氧化应激、营养物质和化学刺激等应激/免疫应答过程。KEGG分析显示富集于TNF、IL-17、NF-κB、Toll样受体和细胞衰老等通路。PPI网络包含95个节点和859个相互作用对。
3.4 预后模型的构建与验证
单因素Cox回归从95个候选治疗靶点中鉴定出22个生存相关基因，LASSO-Cox回归最终保留8个预后基因：CDC25C、GSTM2、BIRC5、EPHB2、NUF2、COL1A1、ADH1C和ACHE。风险评分公式为：Riskscore = 0.096×CDC25C + (-0.074)×GSTM2 + 0.050×BIRC5 + 0.107×EPHB2 + 0.010×NUF2 + 0.035×COL1A1 + (-0.026)×ADH1C + (-0.039)×ACHE。K-M分析显示高风险组患者预后显著较差（HR = 1.40，95% CI = 1.20-1.63，P < 0.001），训练集1、3、5年AUC值分别为0.60、0.60和0.62。在GSE31210和GSE42127外部验证集中均得到一致结果。
3.5 独立预后分析与列线图验证
多因素Cox回归确认风险评分（HR = 1.8，95% CI = 1.34-2.4，P < 0.001）和年龄（P = 0.013）为独立危险因素。构建整合年龄和风险评分的列线图，校准曲线显示1年和3年预测概率与观测结果总体一致，1、3、5年AUC值分别为0.609、0.607和0.604，提示列线图预测能力有限。
3.6 风险分组的GSEA功能富集
高风险组富集于细胞周期、范可尼贫血通路、ECM-受体相互作用、同源重组、DNA复制和错配修复等通路；低风险组富集于醛固酮调节的钠重吸收、抗坏血酸和醛糖酸代谢、碳水化合物消化吸收以及药物代谢-细胞色素P450等通路。
3.7 scRNA-seq分析
质控后GSE198099数据包含21244个基因、20848个细胞，经无监督聚类分为15个簇，注释为10种细胞类型：T细胞、肿瘤相关成纤维细胞、单核细胞、肿瘤细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞、内皮细胞、浆细胞和浆细胞样树突状细胞。定量分析显示肿瘤组织中NK细胞、T细胞和成纤维细胞扩增。8个预后基因中，BIRC5和NUF2在NK细胞中相对高表达，COL1A1在成纤维细胞中优先表达。Wilcoxon检验显示肿瘤组织中成纤维细胞的COL1A1表达显著高于癌旁正常组织（P < 0.05），因此成纤维细胞被选为后续探索性分析的目标细胞群。
3.8 成纤维细胞通讯网络与轨迹分析
CellChat分析显示成纤维细胞与肿瘤细胞之间存在稳健的串扰，CD99、CXCL、THY1、SEMA4、COMPLEMENT、CD46、ANGPT等成纤维细胞特异性信号通路在肿瘤与正常组织间存在差异活性。成纤维细胞进一步分为两个亚群：EMT样成纤维细胞（S100A4、MCAM、ACTA2）和肌成纤维细胞（COL5A1、COL1A1、COL1A2）。Monocle2拟时间轨迹分析将成纤维细胞分为三种不同分化状态，State2具有最高分化潜能且富集EMT样特征，COL1A1在State2中表达相对较高。
3.9 分子对接
选择在单细胞和转录组分析中表达趋势一致的预后基因COL1A1以及靶点数量最多的活性化合物槲皮素进行分子对接，预测结合亲和力为-9.0 kcal/mol，提示二者存在计算预测的潜在相互作用。
3.10 细胞实验
RT-qPCR结果显示，PYYFD处理后ACHE、NUF2、EPHB2、BIRC5和CDC25C的mRNA表达水平呈浓度依赖性显著降低，GSTM2呈相反趋势；高浓度组中ADH1C和COL1A1表达也显著降低。WB结果显示PYYFD处理后COL1A1、NUF2和BIRC5的蛋白表达水平较对照组降低。CCK-8结果显示PYYFD在24、48、72小时均抑制PC-9细胞活力，中、高浓度组效果最强且差异显著。
四、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，NSCLC因早期症状隐匿常在晚期确诊，治疗选择受限。中药可有效降低治疗毒性、增强疗效、缓解症状并改善患者生活质量。本研究中，槲皮素是连接靶点最多的活性成分，已有大量研究证实其通过诱导细胞死亡、抑制增殖和迁移、增强药物敏感性发挥抗NSCLC作用。GO和KEGG富集分析揭示候选靶点富集于TNF信号通路、细胞衰老和药物代谢-细胞色素P450等通路。8个预后基因中，CDC25C作为G2/M期转换的关键磷酸酶，其高表达与NSCLC较短总生存期和晚期病理分期显著相关；GSTM2作为保护因子，可能通过参与氧化应激调节和解毒代谢过程发挥抗NSCLC作用；BIRC5（survivin）通过抑制凋亡、增强恶性细胞有丝分裂和血管生成促进肿瘤进展，是NSCLC的预后生物标志物；NUF2在维持着丝粒微管稳定性和调节细胞周期中发挥作用，其高表达与NSCLC不良预后和淋巴结转移显著相关；EPHB2在NSCLC中发挥致癌因子作用；ADH1C被鉴定为NSCLC的保护因子，但其表达水平变化与保护因子角色之间存在不一致，可能反映疾病状态而非直接介导PYYFD作用；COL1A1作为细胞外基质蛋白，在肿瘤细胞生长、转移和耐药发展中发挥作用，与肿瘤微环境和免疫细胞浸润密切相关。研究构建的预后风险模型虽有一定预测能力（AUC > 0.6），但临床价值有限，距离临床转化仍有距离。
研究结论：本研究共鉴定出95个候选治疗靶点，这些基因显著富集于多个免疫相关通路。进一步研究候选治疗靶点的预后价值，最终确定8个预后基因，包括CDC25C、GSTM2、BIRC5、EPHB2、NUF2、COL1A1、ADH1C和ACHE。这些发现可能为PYYFD治疗NSCLC提供有价值的参考和见解。
