光学相干断层扫描引导的靶向非病毒光学递送视蛋白编码基因至视网膜

《Frontiers in Pharmacology》：Optical coherence tomography guided targeted non-viral optical delivery of opsin-encoding genes into the retina

　　

摘要专业翻译 引言： 视网膜退行性疾病导致进行性光感受器丧失，而内层视网膜神经元群体仍然保留可供光遗传学干预。然而，高效且空间可控的非病毒基因递送至这些存活细胞仍具挑战性。研究人员评估了光学相干断层扫描（OCT）引导的纳米增强光学递送（NOD），用于将多特征视蛋白MCO-020靶向递送至退行性视网膜。 方法： NOD利用等离激元金纳米棒（GNRs）和980 nm近红外激光瞬时透化细胞膜并促进局部质粒递送。递送参数首先在HEK293细胞中优化。随后在rd1小鼠玻璃体内给予MCO-020质粒和GNRs后进行OCT引导激光递送，评估体内疗效和安全性。评价指标包括转基因表达、视网膜结构、视网膜和皮层电生理反应、眼内压、视网膜细胞活力及生物分布。 结果： 体外研究证明在所测试的操作范围内，MCO-020表达呈激光依赖性和空间限制性，且无可检测的细胞毒性。体内研究中，OCT引导的NOD在靶向视网膜区域内产生内层视网膜细胞中的MCO-020表达，且无可检测的视网膜结构或厚度变化。与未治疗对照组相比，MCO-020治疗小鼠表现出增强的光诱发视网膜反应和视觉诱发电位皮层反应，反应和转基因表达在52周观察期内持续可检测。视网膜细胞活力、眼内压和补充电生理安全性评估显示无可检测的治疗相关不良效应。生物分布分析显示在评估的非靶组织中仅有低水平载体DNA。 讨论： 这些发现证明OCT引导的NOD能够向退行性视网膜提供空间靶向的非病毒视蛋白编码质粒递送，同时保持视网膜结构并支持视觉通路的持续功能参与。该方法可能为受变性影响的视网膜区域提供局部治疗基因递送平台。

论文解读

一、研究背景与目的

视网膜退行性疾病是全球范围内不可逆视力丧失的主要原因，且随人口老龄化日益普遍。这类疾病以视网膜细胞（尤其是光感受器和视网膜色素上皮RPE）的进行性变性为特征，包括干性年龄相关性黄斑变性（干性AMD）、视网膜色素变性（RP）、Leber先天性黑矇（LCA）和Stargardt病等。尽管光感受器退化，双极细胞和视网膜神经节细胞等高级视网膜神经元在较长时间内仍保持完整，这为通过将这些存活神经元转化为感光细胞来恢复视觉功能提供了机会。

基因治疗已成为治疗视网膜退行性疾病的重要策略。目前大多数眼科基因治疗依赖腺相关病毒（AAV）等病毒载体，但存在包装容量有限（通常小于4.7 kb）、可能诱发炎症和免疫反应、潜在基因组整合风险以及缺乏空间控制等局限。对于以局部变性为特征的疾病（如晚期AMD的地图样萎缩），能够将治疗基因递送至空间靶向的视网膜区域尤为重要。

光遗传学方法通过使存活的视网膜神经元具有光敏感性来恢复光感受器变性视网膜的视觉反应。研究人员已开发出可由环境光激活的宽带多特征视蛋白（MCO），并已在晚期视网膜色素变性和Stargardt病患者中开展临床评估。为实现高效且空间可控的MCO基因递送，研究人员开发了纳米增强光学递送（NOD）方法，利用近红外激光和金纳米棒（GNRs）实现靶向质粒递送，并进一步将其与光学相干断层扫描（OCT）成像整合，以实现实时结构引导的精准基因递送。

二、研究内容与主要结论

本研究旨在评估OCT引导的NOD平台用于将MCO-020视蛋白基因靶向递送至退行性视网膜的可行性、安全性、持久性和功能性。研究首先在HEK293细胞中优化递送参数，随后在rd1小鼠（Pde6b基因突变导致快速光感受器变性）和激光损伤模型中评估体内递送效果。研究结果表明，OCT引导的NOD能够在激光靶向区域内实现内层视网膜细胞中MCO-020的稳定表达，且无可检测的视网膜结构损伤、细胞毒性、眼内压改变或非靶组织分布。功能评估显示治疗小鼠的视网膜电生理反应和皮层视觉诱发电位显著增强，且持续至52周。该研究为视网膜退行性疾病提供了一种微创、空间靶向的非病毒基因治疗平台。

三、主要关键技术方法

研究采用的主要技术方法包括：OCT引导的NOD递送系统，该系统整合了840 nm低相干超发光二极管的谱域OCT成像子系统与980 nm连续波近红外激光递送子系统，两束光通过光纤耦合器共享同一光路，实现实时成像引导下的精准激光递送；等离激元金纳米棒（GNRs）作为纳米增强剂，经5 kDa羧基末端聚乙二醇（PEG）功能化，平均尺寸约120 nm长、25 nm宽，zeta电位约?28 mV，纵向等离激元吸收峰与980 nm激光波长匹配；玻璃体内注射MCO-020质粒与GNR混合物后进行OCT引导激光照射；电生理记录系统（NS-NEEL）用于视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）记录；谱域OCT用于纵向视网膜结构成像和厚度测量；共聚焦荧光显微镜用于转基因表达分析；NC3000自动化细胞分析系统用于视网膜细胞活力评估。动物模型包括rd1小鼠（C3H/HeJ-Pde6brd1，购自Jackson Laboratory）和532 nm绿色激光诱导的局灶性光感受器损伤野生型小鼠模型。

四、研究结果

体外验证纳米增强光学递送（NOD）

免疫染色显示，MCO-020转基因表达仅发生在接受激光照射的HEK293细胞中，未照射细胞无可检测表达，证实激光激活是质粒进入细胞的必要条件。增加激光功率和照射时间可增强报告基因表达，20 mW、400 s条件表达最强。空间选择性实验显示，强表达仅限于激光靶向区域，相邻未照射区域信号可忽略。MTT细胞活力检测显示，在GNR浓度0.02–0.08 μg/μL和激光功率10–30 mW范围内均无可检测细胞毒性。

体内OCT引导NOD靶向视网膜基因递送

OCT B-scan成像显示，激光照射后视网膜结构无破坏或额外组织损伤，视网膜厚度测量在治疗前后无统计学显著差异。共聚焦显微镜证实激光靶向区域内视网膜细胞中MCO-020转基因的稳健表达。纵向定量分析显示转基因表达在递送后持续数月，12个月时仍可检测到表达。

内层视网膜细胞中MCO-020的稳健表达

共聚焦免疫荧光显微镜显示，激光照射区域内层视网膜细胞中mCherry报告基因强表达。定量分析表明，表达MCO的细胞数量随激光功率增加而增加，20 mW、400 s条件获得最高转染细胞密度。

MCO-020递送后视觉反应的功能恢复

VEP记录显示，MCO-020递送后出现剂量依赖性VEP反应增强。强转基因表达动物的皮层VEP反应清晰可检测，治疗组平均VEP振幅约15 μV，显著高于未治疗对照组的约6 μV（p < 0.05）。眼内压测量显示治疗眼与对照眼无显著差异。

NOD介导基因递送的安全性评估

治疗后2周视网膜细胞活力分析显示，未治疗对照组、仅激光组、仅GNR组和GNR联合激光组之间无显著差异。纵向眼内压监测显示治疗组与对照组保持相当。野生型小鼠中ERG、OCT视网膜厚度和VEP记录均显示治疗无有害影响。12个月生物分布分析显示，脑、性腺、肾、肠系膜、脾、心、肺和肝等非靶组织中MCO-020载体DNA均低于检测限（50拷贝/ng DNA）。

激光损伤模型中的局部视网膜功能恢复

绿色激光诱导局灶性光感受器损伤后，损伤区域微视野ERG反应显著降低。OCT引导NOD递送MCO-020后1周内，局灶ERG反应显著恢复，证明受损视网膜区域局部功能的恢复。

五、讨论与结论

讨论部分指出，NOD平台的关键优势在于空间靶向递送能力。对于地图样萎缩等局部变性疾病，OCT引导可识别变性区域并实现精准递送，最大限度减少对健康组织的暴露。与病毒载体相比，NOD无需病毒即可递送质粒DNA，消除病毒整合和免疫激活风险，且可递送超过病毒包装容量的大片段基因载荷。研究局限性包括未通过从无效暴露到组织损伤阈值的递增来确定完整治疗窗口，以及未进行直接视网膜温度测量和GNR特异性热建模。研究结论表明，OCT引导的NOD能够实现空间靶向的非病毒MCO-020基因递送至视网膜神经元，产生持续转基因表达和改善的视网膜及皮层电生理反应，且无可检测毒性。该平台除光遗传治疗外，还可能用于递送其他治疗基因和基因编辑工具，为包括地图样萎缩在内的视网膜退行性疾病提供微创靶向基因治疗策略。