新型金刚烷-硝酮杂合体TA1的设计合成及其通过清除ROS/ONOO?、缓解钙超载、改善BBB通透性和调控多信号通路对抗缺血性脑卒中

《Frontiers in Pharmacology》：Novel adamantane-nitrone hybrids: design, synthesis, and their multi-target neuroprotective effects against ischemic stroke

　　

缺血性脑卒中（ischemic stroke）涉及相互关联的病理过程，包括钙超载（calcium overload）、氧化应激（oxidative stress）、凋亡（apoptosis）和炎症（inflammation）。这种复杂性使针对单一靶点的治疗面临挑战，而有限的血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）通透性可限制药物向脑内递送。本研究旨在开发具有良好BBB通透性和多靶点神经保护活性的杂合化合物（hybrid compounds）。

方法：合成四种金刚烷-硝酮杂合体（adamantane–nitrone hybrids，TA1–TA4），并筛选其细胞毒性（cytotoxicity）和神经保护活性（neuroprotective activity），最终选择TA1。随后在体外评估TA1对钙超载、氧化应激、线粒体功能（mitochondrial function）和BBB通透性的影响，并在大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）小鼠中评估其治疗疗效及相关信号通路（signaling pathways）。另评估单次给药安全性。

结果：TA1在四种杂合体中显示出最高的神经保护活性和最低的细胞毒性。它减轻钙超载，清除活性氧（reactive oxygen species, ROS）和过氧亚硝酸盐（peroxynitrite, ONOO^?），并稳定线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential）。TA1具有良好BBB通透性（P_app = 6.73 × 10^?6 cm/s），并改善缺血诱导的屏障破坏。在MCAO小鼠中，静脉注射TA1使脑梗死体积（cerebral infarct volume）从32.97%降至14.33%，优于阳性对照TBN（tetramethylpyrazine nitrone）。它还减轻脑水肿（brain edema）并改善神经行为学结局（neurobehavioral outcomes）。TA1调节Bax/Bcl-2/caspase-3、Nrf2/HO-1和NF-κB通路。单次静脉注射136 μmol/kg后48 h，所测血液学（hematological）、生化（biochemical）或组织病理学（histopathological）指标未见明显异常。

讨论：TA1兼具良好的BBB通透性与多靶点抗凋亡（anti-apoptotic）、抗氧化（antioxidant）和抗炎（anti-inflammatory）作用，支持其作为缺血性脑卒中治疗候选药物进一步研究。

缺血性脑卒中（ischemic stroke，脑梗死）是全球死亡和残疾的重要原因，其病理机制涉及复杂级联反应。缺血核心区和半暗带中，氧糖剥夺诱导谷氨酸病理释放，激活含NR2B亚基的突触外NMDA受体，导致细胞外Ca²⁺大量内流。兴奋毒性进一步激活神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）并诱导线粒体功能障碍，产生大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）和过氧亚硝酸盐（peroxynitrite, ONOO^?）。这些自由基可损伤星形胶质细胞上的谷氨酸转运体-1（glutamate transporter-1, GLT-1），阻碍谷氨酸清除，形成兴奋毒性与氧化应激之间的正反馈环，最终加重不可逆神经元凋亡。因此，开发能同时干预该循环多个关键节点的神经保护策略，是缺血性脑卒中药物发现的重要方向。近年来，硝酮类自由基清除剂在卒中治疗中受到关注。其中，TBN（tetramethylpyrazine nitrone）由硝酮与中药川芎有效成分四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine, TMP）结合而成，可捕获超氧阴离子（O₂^•?）、羟自由基（^•OH）和ONOO^?，保护线粒体并减轻氧化损伤。尽管TBN具有自由基清除能力和脑渗透性，但面对卒中复杂病理网络，仍可通过结构修饰进一步增强膜通透性和多维神经保护机制。与此同时，金刚烷衍生物如美金刚（memantine）可阻断细胞外Ca²⁺过度内流，减轻兴奋毒性；金刚烷骨架具有高亲脂性和三维对称笼状结构，常作为功能载体改善中枢作用药物的血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）通透性。基于硝酮-吡嗪药效团与金刚烷骨架融合策略，研究人员设计并合成TA1–TA4，系统评价其细胞相容性、抗OGD/R（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，氧糖剥夺/复氧）损伤、抗凋亡、抗氧化、钙稳态、线粒体保护、BBB通透性及体内心脑保护作用。

关键技术方法（≤250字）：合成采用3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲醛与取代金刚烷胺缩合，经m-CPBA（m-chloroperoxybenzoic acid）氧化及乙腈回流异构化，柱层析纯化，¹H NMR、¹³C NMR和HRMS表征。体外使用PC12、BV2、SH-SY5Y细胞（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞库）和bEnd.3细胞，建立OGD/R和t-BHP损伤模型，采用CCK-8、Annexin V-FITC/PI流式、JC-1、DCFH-DA、DHR123、Fluo-3 AM共聚焦，建立bEnd.3 Transwell BBB模型并行TEER（transendothelial electrical resistance）、HPLC（high-performance liquid chromatography）和钠荧光素通透性检测。体内使用ICR小鼠（南通大学实验动物研究中心）和C57BL/6J小鼠（斯贝福（北京）生物技术有限公司），建立MCAO模型，行TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）染色、H&E（hematoxylin and eosin）/Nissl染色、行为学、Western blot及单次给药安全性评价。

研究结果：
3.1 TA1–TA4的合成：研究人员通过三步序列合成TA1–TA4，经柱层析获得纯度>95%的目标物，并用¹H NMR、¹³C NMR和HRMS完成结构表征。
3.2 TA1的体外生物相容性评价：CCK-8实验显示，TA1在100 μM下神经细胞存活率高于90%，细胞毒性低于TA2、TA3、TA4和TBN。
3.3 TA1抑制程序性细胞死亡并减轻OGD/R诱导的神经元损伤：在PC12、BV2和SH-SY5Y细胞OGD/R模型中，TA1 50和100 μM浓度依赖提高存活率，100 μM使存活率超过75%，流式检测显示其降低BV2细胞凋亡，效果优于等剂量TBN。
3.4 TA1拮抗t-BHP诱导的氧化应激损伤和钙超载：在t-BHP损伤模型中，TA1恢复细胞活力，降低Fluo-3AM、DCFH-DA和DHR123荧光强度，恢复JC-1红/绿荧光比值，表明其减轻Ca²⁺超载、清除ROS/ONOO^?并稳定线粒体膜电位，效果优于TBN。
3.5 BBB通透性及对屏障破坏的保护作用评价：bEnd.3 Transwell模型显示TA1的P_app为6.73 × 10^?6 cm/s，高于TBN的5.16 × 10^?6 cm/s；OGD/R后bEnd.3存活率约55%，TA1提高存活并优于TBN；钠荧光素通透性由模型组约219%降至TA1组约113%。
3.6 TA1在缺血性脑卒中中的治疗疗效评价：MCAO小鼠中，TA1使脑梗死体积从约32.97%降至约14.33%，优于TBN，并减轻脑水肿；H&E和Nissl染色显示TA1剂量相关保护海马CA1、CA3、DG和皮质神经元结构及尼氏物质；Zea Longa评分、cylinder test和corner test显示神经行为学改善。
3.7 化合物TA1对MCAO小鼠缺血半暗带Nrf2/HO-1、凋亡和NF-κB通路的影响：Western blot显示TA1剂量依赖恢复Nrf2和HO-1表达，逆转Bax升高、Bcl-2降低和cleaved caspase-3升高，降低p-IκBα及核内p-p65，高剂量TA1对cleaved caspase-3、p-IκBα和p-p65的改善优于等摩尔TBN。
3.8 TA1的安全性评价：单次静脉注射136 μmol/kg后48 h，ALT、AST、UREA、CREA、RBC、HGB和PLT等指标处于正常范围，心、肝、脾、肺、肾H&E染色未见明显异常。

讨论部分总结：研究人员认为，TA1通过融合TBN的硝酮-吡嗪自由基清除药效团与金刚烷骨架，实现了多靶点作用。TA1不仅清除ROS和ONOO^?，还比TBN更有效地抑制钙超载；钙超载是线粒体功能障碍和氧化应激的上游触发因素，因此TA1保护线粒体并打断兴奋毒性与氧化应激之间的恶性循环。TA1上调Nrf2/HO-1抗氧化防御，恢复Bax/Bcl-2平衡，抑制caspase-3，并抑制NF-κB通路中p65磷酸化和核转位，体现抗凋亡、抗氧化和抗炎协同机制。金刚烷骨架提高BBB通透性，TA1的P_app优于TBN，并减轻OGD/R诱导的bEnd.3损伤和屏障高通透。单次136 μmol/kg给药后48 h未见明显毒性，但仅代表短期耐受性评估。研究局限包括：BBB通透性仅用体外bEnd.3单层模型评价，不能替代体内药代动力学和脑暴露定量；仅观察单次给药后24–48 h的急性疗效和短期安全性，长期疗效、重复给药耐受性和长期毒性未知；需进一步开展血浆和脑组织采样、药代/药效分析、延长行为学随访及重复给药安全性研究。

研究结论部分翻译：综上，通过将金刚烷部分与硝酮-吡嗪支架进行结构融合，本研究鉴定TA1为高效多靶点神经保护剂。通过同时阻断钙超载、清除反应性自由基、保护线粒体功能，并协同调节Nrf2/HO-1、Bax/Bcl-2和NF-κB通路，TA1成功打断缺血级联。与先导化合物TBN相比，TA1具有更优疗效和BBB通透性，因此成为具有治疗缺血性脑卒中显著潜力的创新候选药物。