基于SCOPE的靶标与通路富集分析揭示组胺H1受体（HRH1）作为exodosis的调控因子

《Frontiers in Pharmacology》：SCOPE-based target and pathway enrichment identifies the histamine H1 receptor as a regulator of exodosis

　　

引言： 表型筛选能够在无需预先设定靶标的情况下发现小分子化合物，但由于多药理学效应和通路复杂性，其机制解读仍具挑战性。 方法： 研究人员开发了SCOPE（Screening Compound Ontology for Pathway Enrichment，筛选化合物通路富集本体），这是一个基于KNIME的计算框架，可将化合物层面的筛选数据与已注释的靶标和通路关联起来，以促进机制假说的生成。SCOPE整合了多来源的靶标注释，并以所筛选的化合物文库为背景，进行序贯的靶标层面和通路层面的统计富集分析，以优先排序化合物间共享的作用机制。 结果： 将该框架应用于先前建立的高通量筛选——该筛选针对内质网（ER）应激诱导的内质网驻留蛋白分泌过程（即exodosis）的调控因子——SCOPE在无需先验生物学背景的情况下，鉴定出钙信号通路为最显著富集的KEGG通路。其靶标富集分析揭示了多个与肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3Rs）介导的钙信号通路相关的G蛋白偶联受体（GPCRs），且在降低exodosis的化合物中这些受体被广泛拮抗，提示该通路参与exodosis的调控。值得注意的是，SCOPE发现了组胺受体HRH1在exodosis中的新功能，并通过RNAi敲低、基因敲除和药理学调控进行了验证，表明HRH1可能是调控exodosis的潜在治疗靶点。 讨论： 这些结果凸显了SCOPE在从表型筛选数据中优先排序可经实验验证的靶标和通路方面的潜力。

论文解读文章

一、研究背景与意义

表型筛选是早期药物发现中的重要策略，其优势在于能够在生物学相关系统中直接鉴定活性化合物，而无需预先设定分子靶标。这一方法尤其适用于研究涉及多药理学效应、通路交叉对话以及分子驱动因素尚不明确的复杂生物学过程。然而，表型筛选面临的核心挑战在于：由于小分子化合物的化学多样性和潜在的多药理学特性，对筛选得到的活性化合物（hits）进行机制解读极为困难。单个化合物可能作用于多个靶标，而不同化合物又可能汇聚于共享的信号通路，这使得传统的人工分析方法难以系统性地揭示隐藏的靶标和通路层面的关联。

在本研究中，研究人员关注的核心生物学过程是exodosis——一种内质网（ER）应激诱导的内质网驻留蛋白向细胞外空间分泌的现象。该过程绕过KDEL受体依赖的滞留机制，导致分子伴侣和蛋白修饰酶等通常局限于ER腔内的蛋白质被异常分泌。Exodosis已在神经退行性疾病、高热、缺血再灌注损伤、糖尿病及某些癌症模型中被观察到，这些疾病通常伴随持续的ER应激和钙稳态失调。尽管exodosis与疾病相关的ER功能障碍密切相关，但其驱动机制仍不明确，目前尚无直接靶向或调控该细胞反应的疗法。

此前，研究人员已建立了基于Gaussia荧光素酶的分泌型ER钙调蛋白（GLuc SERCaMP）报告系统，并利用该系统进行了高通量表型筛选，鉴定出185个能够抑制钙耗竭诱导的exodosis的化合物。然而，这些化合物的化学多样性和潜在的多药理学特性阻碍了对其机制的深入解读。因此，亟需一种计算工具，能够系统地将筛选命中化合物与其已知的分子药理学关联起来，揭示共享的靶标和通路层面的关系。

为解决这一挑战，研究人员开发了SCOPE（Screening Compound Ontology for Pathway Enrichment）计算框架。SCOPE的独特之处在于，它以实际筛选的化合物文库为背景进行靶标富集分析，而非使用预设的参考化合物集合，从而能够更准确地反映特定筛选文库的靶标组成和注释密度，避免因背景选择不当而导致的偏差。

二、主要技术方法

研究人员开发并应用了SCOPE计算框架，该框架基于KNIME平台实现。SCOPE整合了来自ChEMBL、IUPHAR、PubChem、PharmGKB和DrugBank五个公共数据库的化合物-靶标相互作用数据，并支持用户提供的基因注释。分析流程包括：化合物结构标准化（使用RDKit将SMILES转换为InChIKey）、通过UniChem进行化合物标识符映射、多数据库靶标注释获取（以10 μM为生物活性截断值，仅考虑人源靶标）、靶标富集分析（采用Fisher精确检验并以Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正，以整个筛选文库为背景）、以及基于STRING数据库的功能富集分析（包括KEGG通路和Gene Ontology Biological Process注释）。此外，研究人员还进行了基于化合物-靶标活性数据的化合物作用分类分析，将化合物分为抑制剂、激活剂、混合型、不确定或未知类别。在实验验证方面，研究人员使用了GLuc SERCaMP报告基因检测、RNA-seq表达分析、CRISPR-Cas9基因敲除、siRNA敲低以及药理学激动剂和拮抗剂处理等方法。本研究的样本来源为SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系，筛选文库为NCATS生物活性化合物库中的10,124个小分子化合物。

三、研究结果

3.1 筛选命中化合物的靶标富集鉴定出exodosis调控因子

研究人员将SCOPE应用于此前建立的10,124个化合物的高通量筛选数据，该筛选鉴定出185个能够降低毒胡萝卜素（thapsigargin）诱导的exodosis的化合物。SCOPE分析结果显示，整个筛选文库中有6,829个化合物获得了化合物-靶标关联数据，共产生44,771个化合物-靶标对，涉及2,702个独特靶标；185个命中化合物中有143个获得了靶标注释，共1,331个化合物-靶标对，涉及392个独特靶标。化学空间分析（基于Morgan指纹的UMAP投影）表明，有靶标注释和无靶标注释的化合物在化学空间中广泛重叠，说明注释覆盖并非局限于特定化学结构区域。

靶标富集分析以5% FDR为阈值鉴定出26个富集靶标。值得注意的是，CYP1A2和CYP3A4虽然是命中化合物中最频繁关联的靶标（分别关联43和40个命中化合物），但由于它们在筛选背景中同样高度代表（分别关联1,827和1,507个化合物），并未达到显著富集阈值。这充分说明了以筛选文库为背景进行富集分析的重要性。

对全部392个映射靶标进行STRING功能富集分析，鉴定出170个富集的KEGG通路，其中排名前十的多为代谢和成瘾相关通路，钙信号通路排名较低。而仅对SCOPE鉴定出的26个富集靶标（FDR<5%）进行分析时，仅得到11个富集KEGG通路，钙信号通路跃居首位。这一重排序效应在5% p值阈值下的70个富集靶标分析中同样得到验证，钙信号通路仍为排名第一的通路。GO-BP富集分析进一步鉴定出232个富集的生物学过程，包括磷脂酶C激活的GPCR信号传导、对组胺的反应、胞质钙调控、螯合钙释放入胞质以及细胞钙稳态等术语。

3.2 多药理学与GPCR介导的ER exodosis调控

在26个富集靶标中，研究人员观察到GPCRs的显著过表达，特别是毒蕈碱受体（CHRM1-5）、血清素受体（HTR1A、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR6）、肾上腺素能受体（ADRA1A、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B）、组胺受体（HRH1、HRH2）和多巴胺受体（DRD1-3、DRD5）。其中多个GPCR偶联G_q蛋白，激活磷脂酶C（PLC）和IP₃受体（IP₃Rs）信号通路，介导ER中Ca²⁺的释放。基于这一共享信号轴，研究人员假设命中化合物可能通过拮抗IP₃R通路信号来减弱exodosis。

对与26个富集靶标相关的55个命中化合物进行活性分类分析显示，多个化合物被注释为多个GPCR的抑制剂，可能作为泛拮抗剂发挥作用。例如，溴隐亭（bromocriptine）虽然经典上被认为是多巴胺D2受体（DRD2）激动剂，但SCOPE分析揭示其具有更复杂的多药理学特征——对部分多巴胺和血清素受体表现为激动剂注释，对肾上腺素能受体及其他多巴胺和血清素受体则表现为拮抗剂注释。这一发现为此前研究中溴隐亭抗exodosis活性与多巴胺能活性无关的观察提供了新的解释。

此外，部分命中化合物表现出对单个富集靶标的更选择性抑制注释，包括靶向HRH1的azacyclonol（NCGC00016366）、靶向HTR2A的lobeline（NCGC00024378）、靶向DRD2的2-CMDO（NCGC00024788）、抑制ADRA1A的AR-C239（NCGC00024880）、抑制HTR6的SB-258585（NCGC00025328）以及靶向SLC6A2的esreboxetine（NCGC00025335）。值得注意的是，多个FDA批准的选择性抗组胺药也出现在命中列表中，包括酮替芬（ketotifen）、赛克利嗪（cyclizine）、氯马斯汀（clemastine）、地氯雷他定（desloratadine）和氯环利嗪（chlorcyclizine），这促使研究人员进一步研究组胺受体信号在exodosis调控中的作用。

3.3 组胺受体沉默减弱exodosis

研究人员利用GLuc SERCaMP报告系统在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中研究了组胺信号在exodosis中的作用。RNA-seq分析显示，SH-SY5Y细胞中HRH1和HRH3有可观的表达，而HRH2和HRH4几乎检测不到。在无毒胡萝卜素诱导的ER应激条件下，使用两种选择性HRH1激动剂——N-甲基组胺普罗地芬（N-methylhistaprodifen）和2-吡啶乙胺（2-pyridylethylamine）——处理细胞，均导致GLuc SERCaMP信号增加，表明exodosis反应增强。在HRH1基因敲除细胞中，2-吡啶乙胺诱导的exodosis增强效应被完全消除，证明激动剂诱导的exodosis增强特异性地通过HRH1介导。siRNA介导的HRH1敲低同样显著降低了组胺受体激动剂诱导的exodosis反应。

研究人员进一步评估了药理学抑制HRH1在ER应激条件下的效应。三种选择性组胺受体拮抗剂——卢帕他定（rupatadine，pIC₅₀ 8.4）、氮卓斯汀（azelastine，pK_i 8.9，FDA批准）和氯马斯汀（clemastine，pK_i 10.3，FDA批准）——均显著降低了毒胡萝卜素诱导的GLuc SERCaMP信号。浓度矩阵组合实验结合Bliss独立性模型分析显示，三种拮抗剂在大部分浓度组合中均与毒胡萝卜素呈现拮抗相互作用（ΔBliss均值分别为：rupatadine 0.105，95% bootstrap CI 0.082–0.129；azelastine 0.151，95% CI 0.129–0.176；clemastine 0.148，95% CI 0.125–0.172），表明HRH1拮抗剂以剂量依赖方式对抗毒胡萝卜素诱导的exodosis。

四、讨论与结论

本研究开发并验证了SCOPE计算框架，该框架通过整合化合物-靶标注释与序贯的靶标和通路富集分析，能够从表型筛选数据中生成并优先排序机制假说。SCOPE的独特优势在于以实际筛选文库为背景进行富集分析，从而能够将分析聚焦于相对筛选背景显著过表达的候选靶标，避免了对高频但非特异性靶标的误判。

本研究存在以下局限性：第一，筛选文库中有3,295个化合物（占32.6%）和42个命中化合物（占22.7%）缺乏靶标注释，可能使分析偏向于注释更完善的化合物和靶标；第二，SCOPE目前仅在一个表型筛选数据集中进行了评估，其泛化性有待在更多独立筛选中验证；第三，HRH1的实验验证主要在SH-SY5Y细胞中进行，结果可能不完全适用于其他细胞类型或体内系统；第四，SH-SY5Y细胞中HRH3也有可观表达，但HRH3未在FDR富集靶标中，其是否参与exodosis调控尚待研究。

总体而言，SCOPE的应用不仅揭示了exodosis的新调控因子HRH1，还展示了化合物-靶标富集如何帮助在多药理学筛选命中化合物中优先排序共享靶标和通路。研究人员预期SCOPE可推广应用于其他复杂表型筛选，有助于弥合高通量发现与系统层面解读之间的鸿沟，加速机制无关的药物发现和药物重定位。