南非废水中的抗生素耐药性：两座污水处理厂及其受纳河流的断面快照

《Frontiers in Water》：Antibiotic resistance in South African wastewater: a snapshot from two treatment plants and their receiving rivers

　　

摘要专业翻译 废水处理厂（WWTPs）是抗生素耐药菌（ARB）和抗生素耐药基因（ARGs）进入水生环境的潜在储库和传播途径。南非大多数WWTPs采用活性污泥工艺，该工艺可能无法完全去除ARB和ARGs，从而可能加剧环境中的抗菌药物耐药性（AMR）。本研究调查了南非豪登省两座WWTPs及其受纳河流中推定肠球菌属（Enterococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）的理化参数、细菌发生情况、抗菌药物敏感性及基因组特征。出水理化参数保持在法规规定的pH和温度范围内（pH 7.25–7.51；温度16.73–22.33 °C），溶解氧（DO）增加26.77%–125%，总溶解固体（TDS）范围为170–326 ppm。在2023年6月、8月和10月下旬三个采样时段，从进水、出水、上游和下游位点共采集72份水样。通过膜过滤和选择性培养对目标细菌进行计数，随后进行生化鉴定和抗菌药物敏感性试验（AST）。推定肠球菌和葡萄球菌浓度范围分别为6.074–7.423和6.576–7.255 log CFU/mL。WWTP1的细菌去除率有限（0.68%–10.76%），而WWTP2实现了89.5%–90.5%的去除率；下游浓度普遍超过上游水平。在54株接受AST的分离株中，有6株符合预定的多重耐药（MDR）标准。肠球菌分离株对替考拉宁、阿奇霉素和四环素表现出耐药性。全基因组测序（WGS）鉴定出4种屎肠球菌（E. faecium）序列型（ST1052、ST1058、ST94和ST32）和1种多重耐药金黄色葡萄球菌（S. aureus）序列型（ST243）。屎肠球菌携带msr(C)、erm(B)和lsa(A)基因，而金黄色葡萄球菌携带norA和norR基因。总体而言，在处理后的废水和受纳河流中检测到MDR细菌和临床相关的耐药决定簇，表明WWTPs可能介导耐药菌在水生环境中的环境传播。

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一、研究背景与意义

抗生素耐药性（AR）已成为全球最紧迫的公共卫生威胁之一，其根源在于抗生素的持续过度使用、误用和不当处置。世界卫生组织（WHO）全球抗生素耐药性监测系统（GLASS）报告估计，全球六分之一的细菌感染对常用抗生素表现出耐药性。废水处理厂（WWTPs）日益被视为ARB和ARGs出现与传播的关键环境热点，因为这些处理厂接收来自医院、家庭、兽医和农业活动以及制药工业的含有抗生素、ARB和ARGs的废水。废水中丰富的营养物质促进细菌生长和水平基因转移，而未完全代谢的抗生素污染物则形成有利于耐药菌的选择压力。

在南非，大多数WWTPs采用活性污泥、废水塘、湿地、生物滤池和旋转生物反应器等常规处理技术。这些工艺虽能有效去除可生物降解的有机物，但无法完全去除抗生素污染物、ARB和ARGs。2023年绿滴报告显示，在接受审计的WWTPs中，有334座（39%）被列为需要紧急干预的危急状态，其原因包括基础设施老化、维护不足和人为破坏。污水处理管理不善的公共卫生后果已通过哈曼斯克拉尔霍乱暴发等事件得到证实。尽管对抗菌药物耐药性（AMR）的认识不断提高，但关于南非水生环境中ARB和ARGs的多样性、分布及基因组特征仍存在显著的知识空白。因此，本研究旨在表征南非豪登省两座WWTPs及其受纳河流中推定肠球菌和葡萄球菌属的发生与浓度，并鉴定多重耐药（MDR）分离株的序列型、耐药决定簇和毒力相关基因。

二、主要技术方法

研究人员在2023年6月、8月和10月下旬三个采样时段，从约翰内斯堡两座WWTPs（WWTP1和WWTP2）的进水、出水、上游和下游河流位点共采集72份水样。主要技术方法包括：使用多参数水质仪现场测定水温、pH、总溶解固体（TDS）和溶解氧（DO）；通过0.45 μm硝酸纤维素膜真空过滤浓缩细菌，采用肠球菌选择性琼脂和甘露醇盐酚红琼脂进行选择性培养和菌落计数；采用Kirby–Bauer纸片扩散法按照CLSI指南进行抗菌药物敏感性试验（AST），计算多重抗生素耐药（MAR）指数；对6株MDR分离株（5株推定屎肠球菌和1株推定金黄色葡萄球菌）进行Illumina MiSeq全基因组测序（WGS），使用TORMES v1.3.0进行组装分析，通过Kraken 2确认分类学鉴定，利用MLST数据库进行多位点序列分型（MLST），并分别使用ResFinder和CARD数据库鉴定ARGs，使用VFDB数据库鉴定毒力因子基因。

三、研究结果

理化参数：两座WWTPs进水和出水的pH范围为7.25–7.90，温度范围为15.60–22.33 °C，均符合南非法规限值。TDS在WWTP1为181–336 ppm、WWTP2为175–365 ppm，均低于450 ppm的排放限值。DO范围为24%–125%，WWTP2出水在晚秋出现最高值。上游和下游河流的pH范围为7.18–8.36，TDS范围为113–330 ppm。统计分析未检测到采样位点间或两座WWTPs间的显著差异。DO和TDS结果表明WWTP2的处理效率和出水水质优于WWTP1。

细菌分离与定量：推定肠球菌和葡萄球菌在所有采样位点均被检出。WWTP1的细菌浓度持续高于WWTP2，且肠球菌浓度高于葡萄球菌。WWTP1的细菌去除率仅为0.68%–10.76%，而WWTP2实现了89.5%–90.5%的去除率。WWTP1出水中细菌浓度在所有采样时段均超过1,000 CFU/mL，表明其消毒效率不足。下游河流细菌浓度普遍超过上游，WWTP1下游的升高可能与处理不当的出水排放有关。

抗生素耐药性分析：54株分离株对9种抗生素的药敏试验显示，屎肠球菌对四环素的耐药率最高（各季节22.2%–27.8%），冬季对利奈唑胺的耐药率为18.5%。葡萄球菌对四环素（30.8%）、克拉霉素（16.7%）和阿奇霉素（12.3%）耐药率较高。MAR指数范围为0.13–0.71，最高值（0.71）出现在WWTP1上游河流的推定肠球菌分离株中，表明河流存在预先存在的环境耐药污染。仅2株金黄色葡萄球菌对头孢西丁耐药，提示可能存在甲氧西林耐药。

全基因组测序：WGS鉴定出4种屎肠球菌序列型（ST1052、ST1058、ST94和ST32），其中ST32和ST94此前曾在加纳的猪和山羊中报道并与红霉素、环丙沙星和四环素耐药相关，而ST1052和ST1058可能为南非罕见或未充分报道的谱系。金黄色葡萄球菌分离株为ST243，此前在南非自由州省奶牛中发现并与大环内酯类和四环素多重耐药相关。所有分离株均携带多重耐药基因。屎肠球菌携带msr(C)、ermB和lsaA基因，赋予对大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素和截短侧耳素类等多种抗生素类别的耐药性。四环素耐药基因tetL和tetM最为常见。金黄色葡萄球菌携带norA、norR、ArlS、ArlR、FosB等耐药基因。毒力因子分析显示金黄色葡萄球菌携带最多（55个基因），包括粘附基因（Clf、EbP、icaA–icaC）、毒素基因（HlB、HlD、HlgA–HlgC、lukF-PV、lukS-PV）和铁获取基因（isdA–isdG）等。屎肠球菌1携带24个毒力基因，包括粘附、生物膜、荚膜形成和毒素相关基因（cylA、cylB等）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，WWTP2因设有熟化塘而比WWTP1具有更好的细菌去除效率。WWTP1出水持续高细菌计数表明其消毒工艺存在缺陷，可能向受纳河流释放耐药菌。然而，由于上游也检出耐药菌，WWTPs不能被确认为下游AMR的唯一来源。表型耐药与基因型检测之间存在不一致，可能源于基因调控与表达、突变或替代耐药机制、数据库局限性以及CARD严格阈值导致的假阳性。ARGs的染色体或移动元件定位未确定，其水平转移潜力有待进一步研究。研究局限性包括仅三次采样活动、依赖培养的细菌检测方法以及仅6株分离株进行WGS的小样本量。

研究结论：本研究证实了约翰内斯堡两座WWTPs及其受纳河流中肠球菌和葡萄球菌属、抗菌药物耐药性及ARGs的发生。WWTP2的细菌去除效果优于WWTP1，而WWTP1似乎是下游耐药菌负担的潜在贡献者。WGS进一步在选定的MDR分离株中鉴定出多种ARGs和毒力相关决定簇，但其基因组移动性和来源未能明确确定。这些发现强调了常规监测废水出水和受纳河流的重要性，以支持南非环境AMR的早期检测和管理。