Cardamonin 通过调控 EGFR/PI3K/AKT1/ERK/NF-κB 通路减轻 LPS 激活小胶质细胞诱导的 SH-SY5Y 神经元凋亡

《Frontiers in Pharmacology》：Cardamonin attenuates SH-SY5Y neuronal apoptosis induced by LPS-activated microglia via modulation of the EGFR/PI3K/AKT1/ERK/NF-κB pathway

　　

摘要
引言：小胶质细胞活化诱导的神经炎症（neuroinflammation）在神经退行性疾病（neurodegenerative diseases）发病机制中发挥关键作用。Cardamonin（CD，2^′,4^′-二羟基-6^′-甲氧基查尔酮）是一种存在于多种药用植物中的天然查尔酮类黄酮（chalcone flavonoid），显示出显著抗炎活性。然而，其减轻神经炎症的确切机制仍未完全阐明。
方法：在本研究中，研究人员利用网络药理学（network pharmacology）和分子对接（molecular docking）探究 CD 的潜在靶点和通路。采用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的 BV2 细胞和 BV2/SH-SY5Y 共培养体系，在体外通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光（immunofluorescence）及其他实验检测神经炎症保护机制。
结果与讨论：网络药理学鉴定表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、Rac-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（rac-alpha serine/threonine-protein kinase, AKT1）、热休克蛋白 90α 家族 B 类成员 1（heat shock protein 90 alpha family class B member 1, HSP90AB1）、前列腺素内过氧化物合酶 2/环氧化酶-2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2/cyclooxygenase-2, PTGS2/COX-2）和转录因子 p65（transcription factor p65, RELA）为关键潜在靶点，主要富集通路为 EGFR/PI3K/AKT1、MAPK/ERK 和 NF-κB 信号通路。在 BV2 细胞中，CD 抑制 LPS 诱导的白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和一氧化氮（nitric oxide, NO）产生，并调控 EGFR/PI3K/AKT1/ERK/NF-κB 信号轴。药理学抑制 EGFR 或磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）可重现 CD 的效应，支持该通路的功能性参与。此外，CD 减轻活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累并防止线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential）丢失。在共培养模型中，CD 预处理降低 BV2 条件培养基（conditioned medium, CM）对 SH-SY5Y 神经元的神经毒性。总体而言，这些发现提示 CD 通过调控 EGFR/PI3K/AKT1/ERK/NF-κB 通路减轻神经炎症，减轻炎症和氧化应激反应并提供间接神经保护，支持其在神经炎症相关神经退行性疾病中的潜在应用。

论文主体解读
神经炎症（neuroinflammation）是多种神经退行性疾病（neurodegenerative diseases）病理机制的重要因素。小胶质细胞（microglia）作为中枢神经系统主要固有免疫细胞，是抵御病理损伤的第一道防线。暴露于微环境改变或病理刺激如脂多糖（LPS）、干扰素-γ（IFN-γ）、β-淀粉样蛋白（Aβ）后，小胶质细胞活化并发生形态和表型变化，释放 IL-6、TNF-α、IL-1β、NO 及多种蛋白水解酶。这些炎症分子的过度产生与神经元损伤和突触功能障碍相关，推动神经退行性疾病进展，因此靶向小胶质细胞介导的神经炎症是神经保护的重要策略。植物来源天然物质具有神经保护和抗炎潜力。CD 是天然查尔酮类黄酮，存在于多种传统药用植物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和血管舒张等药理活性。动物模型提示 CD 具神经保护潜力：在 5XFAD 转基因小鼠中减轻认知障碍并抑制神经炎症和凋亡；在脑缺血/再灌注损伤小鼠中激活 HIF-1α/VEGFA 通路；在坐骨神经挤压伤大鼠中促进运动和感觉恢复；体外研究提示其抑制小胶质细胞 NF-κB 活化并减少促炎介质，激活 Nrf2 依赖抗氧化防御。但相关研究有限，分子机制尚不清楚。研究人员因此基于网络药理学预测，采用 LPS 诱导 BV2 细胞和 BV2/SH-SY5Y 共培养体系，探究 CD 是否通过 EGFR/PI3K/AKT1/ERK/NF-κB 通路改善神经炎症。研究发现 CD 可能通过多靶点协同机制发挥神经保护作用，为神经炎症相关神经退行性疾病治疗提供实验依据。
关键技术方法概述：研究人员用网络药理学预测 CD 靶点，涉及 TCMSP、SwissTargetPrediction、BATMAN-TCM，疾病靶点来自 GeneCards 和 OMIM，并用 UniProt 标准化；用 STRING 构建 PPI，Cytoscape 分析，DAVID 进行 GO 和 KEGG 富集；用 RCSB PDB、DoGSiteScorer、LeDock 和 Discovery Studio Visualizer 进行分子对接。体外使用 BV2 小鼠小胶质细胞系（Cat: SCSP-5208）和 SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系（Cat: SCSP-5014），二者来源于上海中国科学院上海细胞生物学研究所。实验包括 LPS 刺激 BV2、CD 预处理、条件培养基转移至 SH-SY5Y，并采用 CCK-8、形态学、RT-qPCR、ELISA、Western blot、免疫荧光、ROS、JC-1、TUNEL 及 LY294002 和 AG-1478 药理抑制实验。
研究结果：
3.1 Acquisition of potential targets and screening of core targets：研究人员从 SwissTargetPrediction、TCMSP、BATMAN-TCM 分别获得 105、28、44 个 CD 靶点，合并去重为 158 个；GeneCards 中 10,781/10,813 条目符合相关性评分大于 1，OMIM 得 147 个疾病靶点，交集 137 个为 CD 靶点。STRING 高置信 PPI 得 354 个互作靶点，Cytoscape 得 122 个核心靶点，MCODE 模块分析后整合出 11 个 hub 基因：EGFR、AKT1、HSP90AB1、ESR1、PRKACA、PTGS2/COX-2、MAPT、CDK1、PPARG、RELA、HDAC1。
3.2 GO function and KEGG pathway enrichment analysis：137 个靶点经 DAVID 分析得 831 个 BP、13 个 CC、102 个 MF。BP 富集于应激反应、激酶活性调节和组织发育，包括氧化应激反应、蛋白定位正调控和肽基丝氨酸磷酸化；CC 包括膜筏、神经元胞体、谷氨酸能突触和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物；MF 包括泛素蛋白连接酶结合、转录辅调节因子结合、RNA 聚合酶 II 特异性 DNA 结合转录因子结合和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性。KEGG 以 P<0.01 得 116 条通路，前列包括人乳头瘤病毒感染、化学致癌物受体激活、MAPK 和雌激素信号，进一步关注 MAPK/ERK、PI3K/AKT 和 NF-κB 通路。
3.3 Molecular docking analysis between CD and target proteins：CD 与 EGFR、AKT1、HSP90AB1、IKKβ、MAPK1、PTGS2 和 RELA 对接，所有结合能低于 ?5 kcal/mol，提示计算层面存在潜在相互作用。
3.4 CD alleviated LPS-induced BV2 cell morphological changes：CCK-8 显示 CD 2–16 μM 不影响 BV2 活力，LPS 2 和 4 μg/mL 降低活力，故选用 CD 2–16 μM、LPS 1 μg/mL。LPS 诱导 BV2 从分枝静息态向阿米巴活化态转变，CD 预处理减轻形态改变并促进恢复分枝状态。
3.5 CD inhibited LPS-induced mRNA expression and release of inflammatory mediators in BV2 cells：RT-qPCR 显示 LPS 上调 IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA，CD 预处理显著抑制；ELISA 显示 CD 降低 IL-6、IL-1β、TNF-α 和 NO 释放。
3.6 CD treatment suppressed EGFR/PI3K/AKT1 signaling pathway and ERK2 activation in LPS-induced BV2 cells：LPS 上调 EGFR、PI3K、AKT1 mRNA，CD 预处理抑制；Western blot 显示 CD 逆转 LPS 诱导的 EGFR、PI3K、AKT1 磷酸化及 ERK1/2 活化。
3.7 CD treatment suppressed NF-κB signaling pathway activation in LPS-induced BV2 cells：CD 抑制 LPS 诱导的 NF-κB p65、IκBα、iNOS、COX2 mRNA 增加；Western blot 显示 CD 逆转 NF-κB p65 和 IκBα 磷酸化，降低 iNOS、COX-2 蛋白；免疫细胞化学显示 CD 抑制 NF-κB p65 核转位。
3.8 CD attenuated ROS production and prevented MMP loss in LPS-induced BV2 cells：DCFH-DA 检测显示 LPS 增加 ROS，CD 剂量依赖减轻；JC-1 检测显示 LPS 导致线粒体膜电位（MMP；ΔΨ_m）崩溃，CD 预处理防止其下降。
3.9 CD reduced neurotoxicity in SH-SY5Y cells induced by activated microglia：研究人员先排除残留 CD 或 LPS 对 SH-SY5Y 的直接作用：LPS 单独降低 SH-SY5Y 活力并致形态损伤，CD 单独无显著影响，CD 与 LPS 共处理未改善，提示 CD 不直接保护 SH-SY5Y。条件培养基共培养中，对照 BV2 CM 的 SH-SY5Y 活力为 99.2%，LPS-BV2 CM 降低活力和损害形态，CD 预处理的 BV2 CM 显著改善。
3.10 CD reduced apoptosis in SH-SY5Y cells induced by activated microglia：TUNEL 显示 LPS-BV2 CM 增加 SH-SY5Y 凋亡，CD 预处理减轻；Western blot 显示 cleaved caspase-3 增加被 CD 预处理减轻。
3.11 Pharmacological inhibition of EGFR and PI3K suppressed LPS-induced inflammatory signaling in BV2 cells：LY294002 或 AG-1478 单独处理降低 LPS 诱导的 AKT1、NF-κB p65、ERK1/2 磷酸化和 iNOS；CD 与抑制剂联用无附加或协同效应，支持 CD 经 EGFR/PI3K/AKT1/ERK/NF-κB 轴发挥作用。
讨论部分总结：研究人员整合网络药理学、分子对接和体外实验，提示 CD 可能通过多靶点协同机制发挥神经保护作用。网络药理学和分子对接预测 CD 靶向 EGFR、AKT1、PRKACA、PTGS2 和 RELA 等关键节点，并调控 EGFR/PI3K/AKT1、MAPK/ERK 和 NF-κB 通路。KEGG 中部分非神经炎症通路如人乳头瘤病毒感染和化学致癌，主要反映数据库注释结构和核心靶点的多效性，本研究聚焦 MAPK/ERK、PI3K/AKT 和 NF-κB 轴。PPI 识别 11 个核心靶点；EGFR 属 ERBB 受体酪氨酸激酶家族，调控增殖、分化和存活，其信号是神经炎症潜在靶点；AKT1 是 PI3K 下游丝氨酸/苏氨酸激酶，调节存活、代谢和炎症；RELA 是 NF-κB 关键亚基，PTGS2/COX-2 是前列腺素合成诱导型限速酶，均参与神经炎症放大。GO 分析显示靶点富集于氧化应激、肽基丝氨酸磷酸化和蛋白激酶活性，核心靶点执行这些功能。实验表明 CD 在 2–16 μM 不影响 BV2 活力，4、8、16 μM 抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、iNOS 和 COX-2。虽然 CD 口服生物利用度有限，但体内 5–20 mg/kg 在 5XFAD 小鼠中改善认知、降低 Aβ 和神经炎症标志物，在大鼠坐骨神经挤压伤中促恢复，在小鼠脑缺血/再灌注中激活 HIF-1α/VEGFA，提示体内神经保护可能通过调节外周免疫信号等间接机制。机制上，CD 降低 LPS 诱导的 EGFR、PI3K、AKT1 mRNA 和磷酸化，降低 NF-κB p65、IκBα mRNA，减弱 p-p65、p-IκBα、p-ERK1/2，抑制 p65 核转位；药理抑制 EGFR 或 PI3K 可模拟 CD 效应且无叠加，支持通路参与。CD 还减少 ROS、防止 MMP 下降，并通过抑制小胶质细胞炎症间接减少 SH-SY5Y 神经毒性和凋亡。局限包括主要基于 BV2 和 SH-SY5Y 永生化细胞系，缺乏原代小胶质细胞和原代神经元验证；跨物种 BV2/SH-SY5Y 条件培养基模型不能完全复现同基因微胶质-神经元相互作用或体内三维组织微环境；CD 体内抗神经炎症疗效尚待动物模型确认。
研究结论翻译：总之，本研究提示 CD 减轻 LPS 刺激 BV2 小胶质细胞中的氧化应激，恢复线粒体膜电位，并减少炎症反应，这些效应与调控 EGFR/PI3K/AKT1/ERK/NF-κB 信号通路相关。此外，CD 通过减弱活化小胶质细胞的炎症反应减少神经元凋亡。这些发现为支持 CD 作为治疗神经炎症相关神经退行性疾病的潜在治疗剂提供了实验证据。