《Frontiers in Immunology》：Integrated transcriptomic and metabolomic analyses identify key metabolites and genes in sepsis-associated acute lung injury
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引言：脓毒症相关急性肺损伤（sepsis-associated acute lung injury，SALI）是脓毒症的一种危及生命的肺部并发症，病死率很高。本研究旨在通过整合多组学数据集，优先筛选可能参与SALI的血清代谢物和基因。方法：采用宣白承气汤（Xu
引言：脓毒症相关急性肺损伤（sepsis-associated acute lung injury，SALI）是脓毒症的一种危及生命的肺部并发症，病死率很高。本研究旨在通过整合多组学数据集，优先筛选可能参与SALI的血清代谢物和基因。方法：采用宣白承气汤（Xuanbai Chengqi Decoction，XCD）处理的大鼠SALI模型进行非靶向血清代谢组学分析。从GEO获取批量RNA测序（bulk RNA-seq）与单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）数据集，从IEU OpenGWAS获取代谢物相关全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）统计量。scPagwas将代谢物遗传信号映射至细胞群体；高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis，hdWGCNA）鉴定细胞特征基因。通过重叠批量差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）、十种机器学习模型和表达验证来筛选候选基因。进行了功能富集、免疫浸润、细胞-细胞通讯、拟时序和scTenifoldKnk虚拟敲低分析。结果：油酰肉碱（oleoylcarnitine）与T细胞显示最强的遗传关联。跨平台整合优先将GIMAP4和RCBTB2确定为枢纽基因，WBP2被保留作进一步验证。它们的表达与改变的免疫浸润相关，尤其是嗜酸性粒细胞，且三基因谱共享62个生物学过程。与单独脓毒症相比，SALI表现出细胞相互作用的数量和强度增加。鉴定出五个T细胞亚群，枢纽基因的虚拟敲低改变了对8个DEGs的调控。讨论：与油酰肉碱相关的代谢变化与SALI中由GIMAP4、RCBTB2和WBP2介导的T细胞失调相关。这些发现是描述性的，需要进一步实验来确定因果关系。
脓毒症相关急性肺损伤（sepsis-associated acute lung injury，SALI）是脓毒症的常见致命并发症，可进展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），90天病死率达35.5%–55.7%。其病理生理涉及过度炎症、免疫失调和代谢失衡，传统治疗存在抗生素耐药和液体超负荷等局限，因此亟需针对炎症与凋亡协同机制的精准治疗。既往研究多聚焦单个炎症因子、免疫细胞群体或信号通路，对免疫细胞间相互作用、多信号通路网络及临床转化认识不足。代谢重编程在免疫调控中发挥关键作用，但SALI中“代谢物–关键基因–免疫细胞”的调控机制仍不清楚，也缺乏多组学水平的系统研究。宣白承气汤（Xuanbai Chengqi Decoction，XCD）临床用于脓毒症、慢性阻塞性肺疾病和呼吸衰竭等危重症，在急性肺损伤中可减轻肺损伤，但其关键代谢靶点、核心调控基因和免疫机制尚未阐明。因此，研究人员以SALI为研究对象，通过整合动物模型代谢组学、公共转录组学和单细胞测序，结合多种生物信息学方法，筛选并优先排序疾病进程中的关键血清代谢物和核心调控基因，阐明其与T细胞的内在关联，系统分析“代谢–基因–免疫”互作网络，旨在更精确地解析SALI分子发病机制，并为该病的早期识别和潜在干预提供科学依据与新视角。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）气管内滴注建立大鼠SALI模型（30只Wistar大鼠，分为对照、LPS、XCD三组），进行液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）非靶向血清代谢组学；从GEO获取批量转录组训练队列GSE66890（29例SALI对28例单纯脓毒症，全血）、验证队列GSE32707（31例脓毒症合并ARDS对58例单纯脓毒症，全血）以及单细胞数据集GSE151263（3例脓毒症相关ARDS对4例单纯脓毒症，外周血单个核细胞）；从IEU OpenGWAS获取油酰肉碱的GWAS统计量；运用scPagwas将代谢物遗传信号映射到细胞群体，运用hdWGCNA鉴定T细胞特征基因，用limma识别差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）后取交集，再经十种机器学习模型（最优为朴素贝叶斯模型）和双队列表达验证筛选候选枢纽基因；最后采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）免疫浸润、CellChat、Monocle拟时序、scTenifoldKnk虚拟敲低和表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）等方法进行功能与互作验证。
研究结果如下。
3.1 XCD显著减轻SALI大鼠模型肺损伤：肺组织苏木精-伊红染色显示LPS导致肺泡充血和炎性细胞浸润，XCD治疗后明显减轻；肺湿干比以及TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-6和IL-1β水平在LPS组升高，在XCD组显著回落，提示XCD可缓解SALI相关肺部炎症和损伤。
3.2 筛选出34个XCD干预SALI的候选代谢物：非靶向代谢组学检测到1472种代谢物；LPS对对照比较有179个差异代谢物（74个升高、105个降低），XCD对LPS比较有61个差异代谢物（34个升高、27个降低）；两组比较中方向相反的代谢物取交集后得到34个候选代谢物。其中仅有油酰肉碱（Carnitine C18:1）对应IEU OpenGWAS记录（met-a-681）。
3.3 油酰肉碱与T细胞存在稳定遗传关联：对GSE151263单细胞数据进行质控后保留24245个细胞，注释为7个主要细胞谱系；scPagwas显示T细胞与油酰肉碱相关遗传信号呈最强正相关，且经bootstrap重采样稳定，因此将T细胞作为优先分析细胞群。
3.4 鉴定出1567个T细胞特征基因：hdWGCNA选择软阈值为7构建共表达网络，获得5个模块；turquoise和blue模块在T细胞中活性较高，合并后得到1567个T细胞特征基因。
3.5 鉴定出20个候选基因并进行功能与互作分析：训练队列GSE66890中SALI对脓毒症共有271个DEGs（151个上调、120个下调），与T细胞特征基因取交集得到20个候选基因；基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集显示核糖体小亚基结合、内质网蛋白加工等通路；STRING蛋白互作网络中GIMAP7-GIMAP4互作评分最高，RAD23A连接9个候选基因。
3.6 NB机器学习模型为最优模型：对20个候选基因用十种分类器评估，朴素贝叶斯（naive Bayes，NB）模型综合性能最优，训练和测试子集AUC>0.7，AUC=0.788，保留C9orf72、GIMAP4、PIM1、GLIPR1、RNF5、REXO2、GABARAPL2、SYNE2、WBP2、DYNLL1、RCBTB2、STOM、PLAC8共13个特征；SHAP分析显示C9orf72和GIMAP4低表达以及PIM1高表达将预测推向SALI。
3.7 GIMAP4、RCBTB2被优先为候选枢纽基因，WBP2列为待验证候选基因：在GSE66890和GSE32707两个队列中，GIMAP4和RCBTB2在SALI中均显著低表达；WBP2在训练集中高表达，但在验证集中差异未达显著，因此被保留为需要进一步验证的候选基因。GSEA显示三基因分别富集到抗原加工提呈、对共生体防御反应、细胞命运决定等生物学过程，三者共享62个生物学过程。跨物种验证中，GIMAP4在人类、大鼠和小鼠中一致下调，RCBTB2在人类和小鼠中一致下调，WBP2缺乏稳定的跨物种支持。
3.8 候选枢纽基因与免疫细胞浸润相关并预测油酰肉碱结合：ssGSEA显示SALI中CD56bright自然杀伤细胞升高，嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞、自然杀伤T细胞和中性粒细胞降低；RCBTB2与嗜酸性粒细胞评分呈正相关（cor=0.646），WBP2与其呈负相关（cor=-0.479）。分子对接预测油酰肉碱与GIMAP4、RCBTB2的结合能分别为-5.6 kcal/mol和-6.0 kcal/mol，与WBP2为-4.4 kcal/mol。
3.9 油酰肉碱直接结合RCBTB2和GIMAP4：SPR实验显示，在25–25600 nM浓度范围内，油酰肉碱与RCBTB2和GIMAP4的结合呈浓度依赖性；平衡解离常数（KD）分别为RCBTB2 1.08×10
-5 M、GIMAP4 4.16×10
-5 M，稳态KD为10.1 μM和10.4 μM，属微摩尔级中等强度结合。
3.10 SALI T细胞中代谢通路激活并呈现特征性转录调控模式：单细胞通路评分显示T细胞中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、柠檬酸循环和丙酮酸代谢活性升高；转录因子推断显示RFX5和REST在树突状细胞中高活性，GATA1在巨核细胞中高活性，MYC和BHLHE40在T细胞中呈中等活性。
3.11 SALI细胞通讯增强：CellChat分析显示SALI组细胞间相互作用的数量和总强度均高于单纯脓毒症组；增加最明显的是CD14+单核细胞与CD16+单核细胞、B细胞、NK细胞之间，以及T细胞与CD16+单核细胞之间的通讯。T细胞主要通过MIF-(CD74+CXCR4)和MIF-(CD74+CD44)轴作为信号发送细胞，SALI中T细胞向NK细胞的信号增强，未检测到T细胞-巨核细胞相互作用。
3.12 候选基因在T细胞中的动态效应：T细胞重聚类得到共刺激、初始、细胞毒性、驻留和调节性T细胞五个亚群；Monocle拟时序显示状态1和驻留T细胞位于轨迹起始，状态4和细胞毒性T细胞位于后期；关键基因中仅GIMAP4在拟时序中后期出现先升后降的动态变化。scTenifoldKnk虚拟敲低GIMAP4、RCBTB2和WBP2分别改变45、46和11个推断的下游基因，与SALI DEGs重叠后得到FGL2、PLAC8、FCGR3A、GIMAP4、RCBTB2、DYNLL1、WBP2和GIMAP7共8个基因。
讨论部分指出，XCD作为全方制剂发挥干预作用，而非单一化合物；UHPLC-QQQ仅用于煎剂化学表征，观察到的肺保护效应可能来自多种成分的协同作用。SALI发病机制复杂，本研究以血清代谢物为切入点，通过多组学整合发现油酰肉碱可作为SALI相关代谢特征，GIMAP4、RCBTB2和WBP2为候选枢纽基因特征，并与T细胞群体存在稳定遗传关联。讨论还提出，油酰肉碱可能反映脂肪酸氧化紊乱，GIMAP4低表达可能影响T细胞凋亡与稳态，RCBTB2涉及泛素介导的蛋白质量控制，WBP2作为转录共激活因子参与炎症信号调控；嗜酸性粒细胞可能通过脂肪酸氧化依赖的抗原提呈功能连接T细胞失调与油酰肉碱代谢改变。MIF信号轴的增强提示T细胞-NK细胞通讯在SALI炎症放大中具有潜在意义。研究局限性包括：LPS气管内滴注模型不等同于盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）模型；后续关联分析均基于公共人类转录组和GWAS数据，样本量有限；研究以生物信息学为主，未进行细胞或动物模型的功能获得/缺失实验；未进一步验证XCD对枢纽基因表达或T细胞功能的具体调控作用。综上，本研究的结论可翻译为：在SALI中，油酰肉碱相关的代谢变化与GIMAP4、RCBTB2和WBP2介导的T细胞失调相关；这些发现是描述性的，需要进一步实验来确定因果关系。
