脊髓热休克蛋白90抑制通过上调CGRP神经元中的双特异性磷酸酶15增强阿片类镇痛作用

《Frontiers in Pharmacology》：Inhibition of heat shock protein 90 in the mouse spinal cord enhances opioid antinociception via the upregulation of dual specificity protein phosphatase 15 (DUSP15) in CGRP neurons

　　

在一系列延伸研究中，研究人员发现热休克蛋白90（Hsp90）在大脑和脊髓中调节阿片信号转导和抗伤害感受方面具有新的作用。脊髓中Hsp90的抑制可增强阿片类药物的抗伤害感受作用，这一发现促使研究者认识到，一种亚型选择性Hsp90抑制剂可以改善阿片类药物治疗，既能增强疼痛缓解又能减少副作用。然而，这种活性的信号机制仍未完全阐明。因此，研究人员从早期的蛋白质组学研究中鉴定出双特异性磷酸酶15（DUSP15）作为Hsp90抑制后脊髓中表达增强的蛋白。利用雄性和雌性CD-1小鼠，研究人员确认了在Hsp90抑制剂（17-AAG）处理后，DUSP15在脊髓背角中表达上调。通过CRISPR和siRNA介导的敲低实验，研究人员证明在甩尾和术后足底切口疼痛模型中，DUSP15对于Hsp90抑制剂处理后的吗啡抗伤害感受增强是必需的。利用免疫组织化学（IHC）和行为学工具，研究人员将DUSP15定位于阿片信号级联中ERK MAPK和AMPK的上游。随后，研究人员通过IHC证明DUSP15的上调至少部分发生在CGRP神经元中，并且利用细胞选择性CRISPR技术显示，CGRP神经元中的DUSP15对于脊髓Hsp90抑制剂处理所观察到的抗伤害感受增强是必要的。这些研究共同进一步拓展了关于Hsp90如何调节阿片信号转导和疼痛缓解的已知机制，并为利用Hsp90抑制剂改善阿片类药物治疗提供了基础科学见解。

研究背景与目的

阿片类药物是治疗中重度疼痛的主要药物，但其临床应用受到耐受性、依赖性和呼吸抑制等严重副作用的限制。Mu阿片受体（MOR）信号转导是一个高度复杂的过程，涉及亚细胞定位、微域组织和不同细胞类型的空间分布调控。尽管已有研究尝试通过偏向性激动剂等手段操纵MOR信号以改善治疗效果，但完整的MOR信号转导级联，特别是连接信号输出与抗伤害感受及副作用之间的分子机制仍不清楚。

热休克蛋白90（Hsp90）作为一种重要的分子伴侣和信号调节因子，参与多种客户蛋白的定位和激酶激活调控。前期研究发现Hsp90对阿片信号具有双向调节作用：在大脑中促进MOR信号和抗伤害感受，而在脊髓中则抑制MOR信号，使得脊髓Hsp90抑制能够增强阿片类药物的镇痛效果。这种增强效应为利用Hsp90亚型选择性抑制剂提高阿片类药物治疗指数、在增强镇痛的同时减少副作用提供了理论基础。然而，脊髓Hsp90抑制增强阿片镇痛的详细信号机制尚未完全阐明。本研究旨在通过分析前期蛋白质组学数据中发现的DUSP15，探讨其在脊髓Hsp90抑制增强阿片镇痛中的作用及其信号机制。

主要技术与方法

研究人员采用雄性和雌性CD-1小鼠（来源于Charles River Laboratories）作为动物模型，所有实验均经亚利桑那大学IACUC批准。关键技术方法包括：非亚型选择性Hsp90抑制剂17-AAG进行鞘内注射（i.t.）处理；CRISPR基因编辑技术（使用Genecopoeia构建的全合一CRISPR克隆靶向小鼠DUSP15，以及使用小鼠CGRP即Calca启动子驱动的选择性Cas9表达载体）和siRNA（来自Integrated DNA Technologies）进行体内基因敲低；行为学实验采用52℃温水甩尾试验评估热痛觉阈值，以及足底切口手术联合von Frey纤维丝检测机械性异常性疼痛；免疫组织化学（IHC）用于检测蛋白表达和细胞共定位；Western blotting验证蛋白水平变化；RT-qPCR验证mRNA水平变化。

研究结果

1. 脊髓Hsp90抑制上调DUSP15表达以促进阿片抗伤害感受

通过分析前期蛋白质组学数据，研究人员发现Hsp90抑制剂17-AAG处理使脊髓中DUSP15蛋白水平升高。IHC证实DUSP15在脊髓背角深层区域呈胞浆样表达，而17-AAG处理后其表达在浅层背角显著增加。利用CRISPR和siRNA两种互补方法敲低脊髓DUSP15后，17-AAG增强的吗啡抗伤害感受效应被完全逆转至基线水平，而单独敲低DUSP15不影响基础吗啡镇痛效果，表明DUSP15是Hsp90抑制增强阿片镇痛的关键下游分子。

2. 确定DUSP15在Hsp90/MOR信号转导级联中的位置

通过结合Hsp90抑制/阿片刺激与DUSP15 CRISPR敲低，研究人员利用IHC检测磷酸化ERK MAPK（pERK）和磷酸化AMPK（pAMPK）的变化。结果显示，DUSP15敲低消除了17-AAG/DAMGO诱导的pERK在背角浅层的网状增强信号，表明DUSP15位于ERK上游。同时，DUSP15敲低恢复了17-AAG处理本应抑制的pAMPK信号，使其维持在活化状态。行为学实验中，在DUSP15敲低后给予AMPK抑制剂dorsomorphin，能够恢复17-AAG增强的吗啡抗伤害感受效应，进一步证实DUSP15位于AMPK上游，并通过抑制AMPK活性来解除其对ERK的负反馈抑制，从而增强阿片信号。

3. DUSP15通过CGRP神经元调节阿片抗伤害感受

IHC共染色显示，17-AAG处理后DUSP15与CGRP在背角浅层发生明显共定位，Pearson相关系数显著增加。利用CGRP启动子驱动的选择性CRISPR在CGRP神经元中特异性敲低DUSP15后，DUSP15-CGRP共定位消失，而其他区域的DUSP15表达不受影响。行为学实验表明，CGRP神经元中DUSP15的选择性敲低同样完全逆转了17-AAG增强的吗啡抗伤害感受效应，证实DUSP15在CGRP神经元中的表达是该增强效应的必要条件。

结论与意义

本研究将前期发现整合为一个更完整的模型：脊髓Hsp90抑制导致DUSP15在CGRP神经元中表达上调，DUSP15通过去磷酸化AMPK，解除AMPK对ERK的负反馈抑制，从而增强ERK信号和MOR下游信号转导，最终增强阿片类药物的抗伤害感受作用。这是首次描述DUSP15或任何双特异性磷酸酶家族成员在阿片抗伤害感受信号中的作用。尽管DUSP15作为磷酸酶促进激酶磷酸化的具体机制尚不明确，且Hsp90调控DUSP15表达的分子途径仍需探索，但本研究为开发基于Hsp90抑制剂的阿片优化治疗策略提供了更深入的基础科学依据。特别是，DUSP15相较于Hsp90具有更局限的表达和功能，未来若能开发DUSP15激动剂，可能以更低的风险实现与亚型选择性Hsp90抑制剂类似的阿片增效效果。