三七皂苷R1通过CKLF1依赖性抑制神经元代谢重编程减轻缺血性卒中

《Frontiers in Pharmacology》：Notoginsenoside R1 attenuates ischemic stroke via CKLF1-dependent suppression of neuronal metabolic reprogramming

　　

背景：缺血性卒中（ischemic stroke）是全球死亡和残疾的主要原因，由脑血流中断引起，驱动代谢及神经元功能障碍。当前疗法——溶栓、取栓和神经保护剂——受限于狭窄时间窗和出血风险。Notoginsenoside R1（NGR1）是一种来自 Panax notoginseng 的生物活性皂苷，表现出多模式神经保护作用，但其与代谢通路的机制性相互作用仍不清楚。目的：研究人员探讨NGR1在缺血性卒中中的神经保护效能，重点聚焦其对CKLF1/CCR5轴和代谢重编程的调节。方法：本研究采用多层次方法，整合体外实验、体内动物研究、计算验证的靶点模拟和基因敲除技术，系统阐明NGR1在缺血性卒中治疗期间对关键指标的调控作用。分子对接和动力学建模首先预测NGR1-CKLF1结合，随后通过细胞热位移试验（CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验验证。体外实验采用PC12细胞氧糖剥夺（OGD）模型评估NGR1的神经保护作用。CCK-8试验、活/死细胞染色、代谢检测试剂盒、TUNEL和JC-1染色、Western blot（WB）分析和免疫荧光（IF）共定位揭示体外代谢重编程机制。体内实验采用永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）模型模拟人类缺血病理生理。通过TTC染色、神经行为测试、Nissl染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）、WB、IF和免疫共沉淀（Co-IP）阐明NGR1治疗后神经元代谢重编程机制。在CKLF1^?/?大鼠大脑中动脉闭塞模型中采用ELISA和WB分析进行药效学评价，确认NGR1对CKLF1的特异性。结果：对接和分子动力学（MD）预测NGR1–CKLF1稳定相互作用；CETSA/DARTS支持直接物理相互作用，但未测定结合亲和力常数。体外，NGR1减轻OGD诱导的代谢失调，抑制凋亡，增强神经元存活。体内实验表明，NGR1减少梗死体积，改善神经行为评分，减轻Nissl体损伤，并缓解炎症反应。机制上，NGR1通过破坏CKLF1-CCR5结合，抑制下游以糖酵解激活为特征的AMPK/mTOR/HIF-1α驱动的神经元代谢重编程。CKLF1敲除消除了NGR1的治疗作用及其在神经元代谢重编程中的作用，确认CKLF1依赖性。结论：NGR1至少部分通过干扰CKLF1/CCR5相关信号减轻缺血性神经元损伤，从而减轻病理性代谢重编程、神经炎症和凋亡。临床相关性需进一步验证。

缺血性卒中（ischemic stroke）由脑血流灌注中断引起，造成局灶性脑缺血-缺氧和神经元死亡，约占全部卒中的80%。当前急性治疗包括重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）静脉溶栓、机械取栓以及依达拉奉（Edaravone）等神经保护剂，但溶栓时间窗通常仅约4.5 h，取栓存在出血和再灌注损伤风险，神经保护策略仍有限。脑缺血后氧和葡萄糖供应不足，氧化磷酸化受抑，神经元被迫转向糖酵解以维持ATP产生；然而糖酵解低效，导致乳酸大量堆积、细胞内酸中毒、血脑屏障（BBB）通透性破坏，并最终加速神经元死亡。CKLF1（chemokine-like factor 1，趋化素样因子1）是一种非经典CC趋化因子样因子，成人脑组织中表达很低，缺血后神经元CKLF1显著上调，并通过其受体CCR5（C-C chemokine receptor 5，C-C趋化因子受体5）参与神经炎症和代谢重编程；但其对神经元糖酵解的调控功能尚未明确。NGR1（Notoginsenoside R1，三七皂苷R1）是三七（Sanchi, Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）中的特征性原人参三醇型皂苷，具有神经保护、抗炎和代谢调节作用，但其直接靶点及与代谢通路的机制联系仍不清楚。因此，研究人员旨在验证CKLF1是否为NGR1直接结合靶点，并阐明NGR1是否通过CKLF1/CCR5轴抑制神经元代谢重编程，从而减轻缺血性卒中。

研究人员采用多层次研究策略，将体外实验、体内动物实验、计算模拟和基因敲除相结合，最终得出NGR1通过靶向CKLF1、干扰CKLF1/CCR5相关信号，抑制AMPK/mTOR/HIF-1α驱动的病理性神经元代谢重编程，进而减轻神经炎症、神经元凋亡和缺血性脑损伤。该研究确认CKLF1是NGR1抗缺血作用的关键分子靶点，为缺血性卒中治疗提供了新的机制解释和潜在干预方向。

关键技术方法：分子对接和分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟预测NGR1-CKLF1结合；细胞热位移试验（cellular thermal shift assay, CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）验证直接结合。体外采用PC12细胞氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）模型，结合CCK-8、活/死染色、TUNEL、JC-1、ATP、乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸、细胞外酸化率（ECAR）、氧消耗率（OCR）、Western blot（WB）和免疫荧光（IF）。体内采用永久性大脑中动脉闭塞（permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO）模型，进行TTC染色、神经行为测试、Nissl染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）、WB、IF和免疫共沉淀（Co-IP）；并在CKLF1^?/?大鼠pMCAO模型中进行药效学验证。样本来源：PC12细胞购自广州Cellcook Biotechnology Co., Ltd；野生型SD大鼠来自Slaughter Jingda Laboratory Animal Co., Ltd（湖南）；CKLF1^?/?大鼠来自中国医学科学院药物研究所。

3.1 NGR1在PC12细胞氧糖剥夺后发挥保护作用。通过CCK-8筛选发现，NGR1在0.1–100 μM范围内无明显细胞毒性，10 μM时对OGD损伤的神经保护最强；活/死染色显示NGR1浓度依赖性减少神经元死亡。代谢检测表明，OGD降低ATP和OCR、升高ECAR、LDH释放和乳酸产生，NGR1可逆转这些改变。WB显示OGD上调CKLF1、CCR5和IL-1β，抑制AMPK磷酸化，增强mTOR磷酸化及HIF-1α表达，并升高PFKFB3和GLUT3；NGR1可恢复AMPK活性，抑制mTOR/HIF-1α信号并使糖酵解相关蛋白正常化。IF显示OGD增强CKLF1/CCR5和CKLF1/HIF-1α共定位，NGR1可减弱该共定位；TUNEL和JC-1染色进一步表明NGR1抑制凋亡并维持线粒体膜电位（ΔΨ_m）。

3.2 CKLF1是NGR1的结合靶蛋白。分子对接预测NGR1与CKLF1结合能为?7.4 kcal/mol，并与Lys9、Asp27、Asn30和Thr34残基形成氢键。100 ns MD模拟显示复合物达到动态平衡，RMSD、RMSF、氢键数、回旋半径和溶剂可及表面积分析支持结构稳定，MM-GBSA结合自由能ΔG_MMGBSA为?69.345 kcal/mol。CETSA显示NGR1使CKLF1热变性曲线右移，Tm增加+7.4 °C；DARTS显示NGR1减少CKLF1的蛋白酶降解，而β-actin不变，支持NGR1直接结合并稳定CKLF1。

3.3 NGR1对永久性局灶性脑缺血损伤具有保护作用。通过TTC染色发现，pMCAO显著增加脑梗死和水肿体积，NGR1及阳性对照依达拉奉可减轻这些病理改变；神经行为测试显示模型大鼠严重神经功能障碍，NGR1和依达拉奉可改善Zea Longa评分、前肢滑落、悬吊和网格试验表现。Nissl染色显示NGR1和依达拉奉逆转皮层和海马CA1区神经元形态损害。ELISA显示pMCAO后IL-1β、TNF-α升高，IL-4、IL-10也升高，NGR1和依达拉奉均抑制促炎因子并上调抗炎因子。

3.4 NGR1抑制脑缺血后CKLF1介导的神经元代谢重编程。IHC显示pMCAO诱导CKLF1过表达，10–40 mg/kg NGR1剂量依赖性抑制CKLF1，且作用强于等剂量依达拉奉。WB显示NGR1阻断CKLF1/CCR5轴活化及下游IL-1β过表达，并恢复AMPK/mTOR/HIF-1α信号，降低PFKFB3和GLUT3。IF共染显示，脑缺血后CKLF1与CCR5、HIF-1α在MAP2⁺神经元中强共定位，NGR1剂量依赖性减弱该相互作用；Co-IP证实CKLF1与CCR5、CKLF1与HIF-1α存在强结合，40 mg/kg NGR1明显削弱这些致病性蛋白复合物。

3.5 CKLF1敲低导致NGR1治疗缺血性卒中的作用显著减弱。在CKLF1^?/?大鼠中，脑缺血后梗死体积较小、脑水肿较轻、神经功能评分较好；但NGR1未能在CKLF1^?/?大鼠中产生额外脑水肿、梗死或神经功能保护。Nissl染色显示NGR1可部分恢复野生型大鼠神经元形态，但对CKLF1^?/?大鼠无组织学保护。ELISA显示CKLF1^?/?缺血大鼠促炎因子较低、抗炎因子较高，NGR1在CKLF1^?/?大鼠中不再调节这些炎症因子。WB显示野生型和CKLF1^?/?大鼠缺血后均出现CCR5、IL-1β、p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3和GLUT3上调及AMPK活化受损，NGR1可逆转野生型大鼠上述异常，但在CKLF1^?/?大鼠中无纠正作用。由此确认CKLF1是NGR1发挥神经保护和代谢调控作用所必需的分子靶点。

讨论部分指出，缺血性卒中后可发生神经炎症、不可逆神经元丢失和脑梗死；成熟神经元主要依赖氧化磷酸化产生ATP，对缺血能量崩溃高度敏感。NGR1可穿透血脑屏障并分布于皮层、海马和纹状体，pMCAO模型可较好模拟临床血栓栓塞性卒中。CKLF1被认为是缺血性脑损伤的重要治疗靶点，本研究将其功能从促炎作用扩展到神经元糖代谢调控。机制上，缺血/缺氧使神经元由氧化磷酸化转向糖酵解，CKLF1/CCR5轴抑制AMPK磷酸化、异常激活mTOR并稳定HIF-1α，上调PFKFB3和GLUT3等糖酵解相关蛋白，形成“缺血性糖酵解转换”，引起ATP耗竭、乳酸堆积、细胞内酸化和ΔΨ_m丧失，最终诱导凋亡；NGR1通过破坏CKLF1-CCR5结合纠正上游代谢紊乱，继而抑制IL-1β、TNF-α释放和凋亡。CKLF1^?/?大鼠中缺血仍可激活AMPK/mTOR/HIF-1α及糖酵解蛋白，提示CKLF1是NGR1保护作用的重要允许节点，但并非缺血诱导代谢重编程的唯一上游驱动。讨论还提出炎症与代谢可能双向关联，形成前馈病理环路；AMPK是中枢能量感受器，其激活对保护作用是否必要和充分仍需研究。转化方面，NGR1不同于直接CCR5拮抗剂maraviroc，其“配体拦截”机制可能保留CCR5与MIP-1α等内源性配体的生理信号，也不同于抗氧化、抗炎、抗凋亡等“损伤拮抗”策略，而是主动重塑神经元能量代谢。局限包括NGR1体内药代动力学尚未完全阐明、PC12细胞不能完全代表原代成熟神经元、全脑匀浆限制细胞类型特异性代谢分析。

结论翻译：本研究表明，NGR1通过靶向CKLF1发挥神经保护作用，从而纠正缺血诱导的代谢失调并抑制外周炎症级联反应。机制上，研究表明CKLF1/CCR5轴通过调节AMPK/mTOR/HIF-1α信号通路驱动以糖酵解增强为特征的病理性神经元代谢重编程，而NGR1通过破坏CKLF1-CCR5结合抑制该重编程，减少神经元凋亡，并限制缺氧-缺血性脑损伤。这些发现确立CKLF1为一个有前景的治疗靶点，为缺血后神经元死亡提供新的机制见解，并加深了对NGR1在缺血性卒中中神经保护作用的理解。