《Chinese Medicine》：Systematic identification of characteristic chemical constituents in Cistanches Herba from saline-alkali land based on hierarchical filtering of mass spectrometry data and spatial metabolomics technology
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**背景**：中药肉苁蓉（Cistanches Herba, CH）的传统生境为中国西北沙漠地区。近年来，CH的种植被引入黄河三角洲地区的盐碱地（saline-alkali land, SAL）。然而，该盐碱环境对CH中次生代谢产物积累的影响尚不清楚。
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**背景**：中药肉苁蓉（Cistanches Herba, CH）的传统生境为中国西北沙漠地区。近年来，CH的种植被引入黄河三角洲地区的盐碱地（saline-alkali land, SAL）。然而，该盐碱环境对CH中次生代谢产物积累的影响尚不清楚。
**目的**：本研究旨在系统表征SAL种植CH的化学轮廓，并鉴定与SAL环境相关的关键化学标记物。
**方法**：研究人员分别从SAL和传统沙地（sandy land, SL）采集CH样品。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS）进行非靶向代谢组学分析，表征两种生境CH的整体代谢轮廓。通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）、超高效液相色谱-三重四极杆质谱（ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, UPLC-TQ-MS）靶向定量以及主成分分析（principal component analysis, PCA）的化合物载荷贡献，筛选与SAL环境相关的化学标记物。随后，采用解吸电喷雾电离质谱成像（desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, DESI-MSI）可视化部分筛选所得成分在小鼠器官中的原位空间分布。
**结果**：非靶向UPLC-QTOF-MS代谢组学从CH样品中鉴定出74种化学成分，包括40种苯乙醇苷类、13种环烯醚萜苷类、9种木脂素类及其他微量成分。正交偏最小二乘判别分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis, OPLS-DA）清晰分离SAL与SL样品组，其中30种成分对组间区分贡献显著。WGCNA揭示23种代谢物与SAL相关。整合上述两种筛选方法，初步选出12种与SAL相关的候选标记物。随后，结合PCA载荷系数（PCA模型经Kaiser–Meyer–Olkin和Bartlett球形检验验证）及UPLC-TQ-MS靶向定量，最终确定4种特征性化学标记物——毛蕊花糖苷（verbascoside）、松果菊苷（echinacoside）、异毛蕊花糖苷（isoacteoside）和松脂素（pinoresinol），且这4种成分在SAL样品中含量均显著升高。DESI-MSI结果进一步表明，松果菊苷主要富集于脑组织中，而毛蕊花糖苷或异毛蕊花糖苷在肺组织中离子信号最强。
**结论**：本研究建立了一种整合质谱数据分层过滤的综合策略，成功鉴定出与SAL相关的4种CH特征性化学标记物。该策略为未来的质量控制与资源开发提供了科学依据。
肉苁蓉（Cistanches Herba, CH）作为代表性的寄生药用植物，传统生境为我国西北沙漠地区。近年来，为改良我国东部沿海地区盐碱地（saline-alkali land, SAL），在耐盐植物柽柳（Tamarix chinensis Lour）根部接种管花肉苁蓉（Cistanche tubulosa），形成了生态修复与资源利用相结合的协同模式。然而，盐碱胁迫对CH次生代谢产物系统性变化的影响此前尚缺乏深入探索。研究者聚焦于黄河三角洲盐碱地种植的CH，以传统沙地（sandy land, SL）样品为对照，系统开展化学成分剖析与特征标记物筛选。研究首先基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）非靶向代谢组学全面表征两种生境CH的化学轮廓，结合正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）筛选差异代谢物；继而引入加权基因共表达网络分析（WGCNA）挖掘与SAL生境高度相关的代谢模块，通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-TQ-MS）靶向定量和主成分分析（PCA）载荷系数逐步收敛候选标记物，最终采用解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）解析代表性成分在小鼠主要脏器中的原位空间分布。结果表明，SAL种植CH的总多酚、总黄酮和可溶性糖含量显著高于SL样品，且二者在形态特征与宏观化学轮廓上存在明显分化。研究共鉴定74种化学成分，其中苯乙醇苷类为主要类别。通过分层过滤策略，最终确定毛蕊花糖苷、松果菊苷、异毛蕊花糖苷和松脂素4种与SAL环境密切相关的特征性化学标记物。DESI-MSI进一步显示松果菊苷在脑组织中富集，毛蕊花糖苷/异毛蕊花糖苷在肺中信号最强，提示其潜在的器官靶向性。该研究为SAL种植CH的质量评价与控制提供了科学依据。研究人员：
**研究背景、现存问题与研究动因**
肉苁蓉（Cistanches Herba, CH）为列当科（Orobanchaceae）寄生草本植物肉苁蓉（Cistanche deserticola Y. C. Ma）或管花肉苁蓉（Cistanche tubulosa (Schenk) Wight）的带鳞叶肉质茎，传统上寄生分布于我国西北沙漠地区，是补益肾阳、填精养血的传统中药。为改良东部沿海盐碱地并实现资源利用，近年来已在黄河三角洲地区建立以柽柳（Tamarix chinensis Lour）为寄主的CH种植模式。盐碱胁迫作为常见非生物胁迫因子，可影响药用植物次生代谢产物的生物合成与积累。但盐碱条件下CH化学成分的系统性变化此前尚不清楚，这一知识空白制约了盐碱地产CH的质量评价与定向开发。
**研究人员开展的研究与结论**
研究人员系统采集了盐碱地（saline-alkali land, SAL）与传统沙地（sandy land, SL）两个生境的20批CH样品（各10批），采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS）非靶向代谢组学进行全面化学剖析，整合正交偏最小二乘判别分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis, OPLS-DA）、加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）、超高效液相色谱-三重四极杆质谱（ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, UPLC-TQ-MS）靶向定量及主成分分析（principal component analysis, PCA）载荷系数等多层次筛选策略，最终鉴定出毛蕊花糖苷（verbascoside）、松果菊苷（echinacoside）、异毛蕊花糖苷（isoacteoside）和松脂素（pinoresinol）4种与SAL环境显著相关的特征性化学标记物，且其在SAL样品中含量均显著高于SL样品。该项研究建立了系统的质谱数据分层过滤方法，为SAL种植CH的质量控制与资源开发提供了科学依据。
**主要关键技术方法**
研究采用的核心技术包括：1）基于UPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学，对SAL与SL两组CH进行全谱化学成分表征；2）OPLS-DA结合变量投影重要性（VIP>1）与差异倍数（fold-change）筛选差异代谢物；3）WGCNA构建代谢物共表达模块，挖掘与SAL生境高度正相关的代谢物集合；4）UPLC-TQ-MS多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）模式对候选成分进行绝对定量验证；5）PCA结合Kaiser–Meyer–Olkin（KMO）与Bartlett球形检验进行数据适用性评估与降维；6）解吸电喷雾电离质谱成像（desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, DESI-MSI）可视化代表性成分在小鼠脑、心、脾、肺、肾等器官及组织分区中的原位空间分布。样品来源包括山东利津盐碱地种植基地和新疆和田、阿勒泰、于田、民丰等沙地种植基地，经DNA条形码技术鉴定均为管花肉苁蓉（Cistanche tubulosa）。
**研究结果**
**CH在SAL与SL生境中的植物学与化学特征差异**
对SAL种植CH的药材性状与显微特征观察显示，其外观呈类圆柱形，表面黄棕色至暗棕色，断面可见黄白色点状维管束呈波状环纹排列，粉末中可见淀粉粒。定量分析显示SAL种植CH的总多酚含量为（42.16±7.46）mg/g，总黄酮含量为（34.29±11.92）mg/g，可溶性糖含量为（19.78±4.49）mg/g，均显著高于SL样品，表明盐碱胁迫可促进CH酚类代谢和渗透调节物质的积累。
**基于UPLC-Q/TOF-MS的CH化学成分鉴定**
研究从CH样品中共鉴定74种化学成分，包括40种苯乙醇苷类、13种环烯醚萜苷类、9种木脂素类及12种其他类成分。质谱裂解规律分析显示，苯乙醇苷类在负离子模式下主要发生酯键断裂（丢失咖啡酰基及脱水产物）和糖苷键断裂（丢失鼠李糖基和葡萄糖基），代表性成分campneoside II的裂解途径得到详细阐明。
**基于代谢组学的CH差异成分鉴定**
主成分分析（PCA）显示SAL与SL样品呈现明显分离趋势。OPLS-DA模型R2Y=0.835，Q2(cum)=0.787，经200次置换检验证实模型无过拟合。S-plot和火山图分析表明42个代谢物特征发生显著变化，其中24种在SAL样品中升高、18种降低。以VIP>1、P<0.05且FC≥1.5或≤0.5为阈值，共筛选出30种潜在差异代谢物。
**基于WGCNA的候选标记物筛选**
对74种化学成分进行WGCNA分析，获得4个共表达模块（蓝、青、棕、灰），其中蓝色模块含23种成分，与SAL组显著正相关（r=0.56，P<0.05）。将蓝色模块中代谢物与代谢组学差异代谢物取交集，获得12种重叠成分，包括9种苯乙醇苷类、1种环烯醚萜苷类、1种木脂素及1种其他类成分，作为候选标记物进入靶向定量验证。
**基于靶向代谢组学的成分定量**
采用UPLC-TQ-MS MRM模式对12种候选成分进行绝对定量。方法学验证显示，各成分线性相关系数R2为0.9989–0.9997，精密度RSD为0.47%–2.21%，重复性RSD为0.79%–2.25%，加样回收率为97.39%–104.40%，表明方法可靠。定量结果显示，与SL样品相比，SAL样品中7种成分含量升高，其中异毛蕊花糖苷增幅最为显著（SL：2313.60±745.76 μg/g；SAL：6425.60±1289.63 μg/g）。
**与SAL相关的CH特征性化学标记物验证**
以12种成分定量结果为变量进行聚类分析，SAL样品与SL样品分别聚为两组，呈现地理来源依赖性差异。KMO值为0.726，Bartlett球形检验统计量为290.418（P=0），满足PCA适用前提。按特征值>1标准提取2个主成分，累计方差贡献率为79.211%。载荷系数分析显示异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、松脂素和肉苁蓉苷F在第一主成分上载荷较高，管花苷A和松果菊苷在第二主成分上载荷较高。结合含量比较，最终确定毛蕊花糖苷、松果菊苷、异毛蕊花糖苷和松脂素为SAL种植CH的特征性化学标记物。
**DESI-MSI喷剂溶剂优化**
对4种标记物进行成像条件优化时发现，毛蕊花糖苷与异毛蕊花糖苷无法区分，松脂素信号强度不足，故选用成像性能更优的肉苁蓉苷F和管花苷A进行条件考察。甲酸添加显著抑制目标离子信号并降低成像分辨率，故排除。在80%、90%、98%三种甲醇浓度中，98%甲醇-水溶液可获得最佳电离效率和信号强度，被确定为后续DESI-MSI分析的最优喷剂溶剂。
**代表性苯乙醇苷类成分在小鼠器官中的空间分布**
采用优化的DESI-MSI方案，对毛蕊花糖苷、松果菊苷、异毛蕊花糖苷和松脂素在小鼠脑、心、脾、肺、肾组织中的原位分布进行可视化分析。结果显示，松果菊苷在脑组织中显著富集，相对含量超过其他3种成分；毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在肺组织中离子信号最强；管花苷A在肾皮质中富集；肉苁蓉苷F在心脏组织特异性富集。组织分区分析揭示，肾组织中毛蕊花糖苷在髓质中显著高于皮质，而松果菊苷和管花苷A呈现相反趋势；脑组织中毛蕊花糖苷和松果菊苷在大脑、脑桥和嗅球中相对含量高于小脑，松果菊苷在各脑区普遍占优。
**讨论与结论**
研究系统阐明了SAL环境对CH次生代谢产物积累的调控作用。SAL种植CH的总多酚、总黄酮和可溶性糖含量显著升高，提示盐碱胁迫通过增强酚类代谢途径和渗透调节物质积累帮助CH抵抗氧化损伤和高渗胁迫。研究建立的分层过滤策略有效弥补了单一非靶向代谢组学筛选易产生假阳性候选物的缺陷：UPLC-QTOF-MS非靶向代谢组学提供广谱差异筛选基础，WGCNA剔除与盐碱胁迫无内在关联的随机波动代谢物，UPLC-TQ-MS靶向定量实现绝对含量验证，PCA降维最终锁定高载荷、高稳定性特征标记物。DESI-MSI空间分布结果揭示了不同苯乙醇苷类成分在小鼠组织中的特异性富集模式，其中松果菊苷在脑组织中的富集为其神经保护作用提供了原位组织学证据，毛蕊花糖苷在肾皮质的富集提示其潜在靶向肾小球和近端小管，肉苁蓉苷F在心脏的特异性分布支持其心血管保护作用。研究最终确定毛蕊花糖苷、松果菊苷、异毛蕊花糖苷和松脂素为与SAL环境相关的CH特征性化学标记物，为SAL种植CH的质量控制、药效物质基础解析及资源可持续利用提供了科学依据。
