《Holistic Integrative Oncology》：Erasing the invisible: targeting persister cells to cure minimal residual disease
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尽管免疫治疗和靶向治疗取得了革命性进展，由微小残留病（minimal residual disease, MRD）和耐药持存细胞（drug-tolerant persister, DTP）驱动的肿瘤复发仍是肿瘤学面临的关键挑战。MRD是常规影像学无法检测、但可
尽管免疫治疗和靶向治疗取得了革命性进展，由微小残留病（minimal residual disease, MRD）和耐药持存细胞（drug-tolerant persister, DTP）驱动的肿瘤复发仍是肿瘤学面临的关键挑战。MRD是常规影像学无法检测、但可通过二代测序（next-generation sequencing, NGS）和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）分析等敏感分子技术识别的残余癌细胞储库，在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中均作为复发的预后生物标志物。在MRD中，DTP细胞以短暂的药物耐受为特征，通过静止、代谢重编程、表观遗传修饰和信号通路激活等适应性机制逃避治疗。这些细胞在介导治疗耐药中起关键作用，从可逆性耐受动态演化为稳定性耐药，从而推动疾病复发。本综述阐明了MRD和DTP细胞的临床意义，详述了其生物学特征、检测技术和形成机制。研究人员重点介绍了靶向DTP细胞的治疗策略，包括通路抑制剂、表观遗传调节剂和自噬阻断剂，以逆转MRD并预防复发。研究还探讨了将这些方法转化为临床实践所面临的挑战，如DTP异质性和生物标志物开发，以及单细胞组学和人工智能驱动分析等新兴技术。通过整合机制见解与创新检测及治疗策略，靶向MRD中的DTP细胞具有增强肿瘤长期治疗结局的变革性潜力。
论文主体内容总结
1 引言
免疫治疗和靶向治疗的问世从根本上改变了肿瘤学领域，为晚期癌症患者带来了前所未有的生存获益。然而，肿瘤复发仍然是普遍存在的挑战。即使在肿瘤初始退缩的情况下，一部分恶性细胞仍常持续存在，随后驱动疾病复发。这些残留细胞通常表现为微小残留病（MRD），作为耐药持存细胞（DTP）出现的储库。DTP细胞代表一种短暂耐药群体，能够逃避标准治疗。临床上，MRD检测可作为复发的早期预警系统，为升级治疗或实施新型联合策略提供决策依据。同时，阐明DTP细胞的生物学特性对于开发阻止其演化为完全耐药克隆的干预措施至关重要。MRD指治疗后持续存在的一小群癌细胞，通常通过二代测序（NGS）或定量聚合酶链反应（qPCR）等敏感分子方法识别。在急性淋巴细胞白血病（ALL）等血液系统恶性肿瘤中，MRD已被确立为可靠的预后指标，其在实体瘤中的相关性也日益受到认可。在实体瘤中，MRD的存在与较差的生存结局相关。在MRD背景下，DTP细胞在介导治疗耐药中发挥关键作用，通过静止、代谢重编程和表观遗传修饰等适应性机制在初始治疗中存活。与携带永久性耐药突变的克隆不同，DTP细胞表现出可逆表型，能够动态适应治疗压力并可能演化为完全耐药的细胞群体。
2 肿瘤治疗中的MRD是什么？
2.1 挑战还是机遇：可靠的预后生物标志物
尽管免疫治疗和靶向治疗取得了显著进展，MRD仍是肿瘤学中的严峻挑战。虽然许多患者在影像学上表现为肿瘤退缩，但循环肿瘤DNA（ctDNA）分析等敏感分子技术常能检测到残留癌细胞，凸显了传统影像学评估的局限性。临床上，MRD与对标准治疗敏感性降低相关，反映了其采用适应性耐药机制的能力。MRD的预后意义深远，是多种恶性肿瘤复发和不良临床结局的关键指标。一项研究中，Mo等人报道了利用ctDNA分析对299例I-III期结直肠癌（CRC）患者进行MRD早期检测的积极结果。术后一个月，ctDNA中六个甲基化标志物中任一阳性检测的患者，其癌症复发可能性是阴性结果患者的17.5倍。类似地，Gale等人分析了88例非小细胞肺癌（NSCLC）患者的363份连续血浆样本，在I、II、III期患者中分别有24%、77%和87%在治疗前检测到ctDNA。治疗后ctDNA检测阳性（可能提示MRD）与不良临床结局相关。
2.2 MRD的检测技术
现有生物标志物存在关键缺陷。异质性使单一标志物无法捕获所有DTP亚群，导致假阴性结果。DTP的表观遗传和表型可塑性使静态标志物难以用于长期监测。极低的DTP频率和正常体细胞背景噪声进一步降低了检测可靠性。为应对这些局限，多种具有不同性能特征的检测技术已被开发用于临床MRD监测。流式细胞术可实现血液系统癌症的快速多参数分析。qPCR/数字PCR（dPCR）可廉价定量已知突变，但无法检测新型DTP亚克隆。二代测序（NGS）革新了MRD分析，尤其在实体瘤中，支持同时监测多个基因组改变，增强了对异质性MRD群体的识别。然而，其成本高、计算密集，且受限于早期疾病中低ctDNA脱落。单细胞质谱流式（CyTOF）通过捕获高维蛋白谱来示踪MRD，但缺乏标准化的临床工作流程。单分子成像提供最高灵敏度但临床不可及。ctDNA允许非侵入性连续监测，但无法确认存活的持存细胞。
3 DTP细胞是MRD的基础
3.1 DTP细胞的发现与演化
DTP细胞的概念代表了理解癌症治疗耐药性的范式转变。“持存者”一词源于微生物学，描述通过非遗传机制在抗生素暴露中存活的细菌细胞。2010年，Sharma等人将该类比延伸至人类癌症，在接受EGFR-TKI厄洛替尼治疗的EGFR突变NSCLC细胞中鉴定出DTP细胞。他们观察到，尽管药物浓度达到致死水平，一小部分细胞仍持续存在，表现出以静止和表观遗传重编程为特征的可逆药物耐受状态。三个核心功能实验被普遍用于定义真正的DTP群体：可逆性实验——药物撤除7-14天后，DTP细胞恢复完全药物敏感性和强增殖能力；单细胞测序遗传表征——DTP细胞不携带稳定的驱动耐药突变，其生存完全依赖表观遗传和代谢适应性可塑性；克隆波动实验——DTP群体在无药物压力连续传代时不产生稳定的耐药亚系。
3.2 MRD中DTP细胞的示踪技术
检测和示踪DTP细胞需要能够解析其在MRD中稀有性和动态行为的前沿技术。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为金标准，提供转录组分辨率以识别DTP特征。在EGFR-TKI治疗的NSCLC中，scRNA-seq揭示了上调应激反应基因（ATF4、KDM5A）并具有静止特征的持存亚群。质谱流式（CyTOF）通过同时分析数十种蛋白标志物进行补充。体内谱系示踪利用荧光报告基因追踪DTP细胞随时间的演化，揭示其从耐受到耐药的转变。液体活检分析循环肿瘤细胞（CTCs）或ctDNA为非侵入性临床追踪提供了替代方案。然而，scRNA-seq和CyTOF需要新鲜样本和复杂生物信息学分析，而液体活检对超稀有DTP细胞缺乏灵敏度，存在假阴性风险。
3.3 DTP细胞与MRD的关系
DTP细胞与MRD之间的相互作用代表了一个引人注目的假说：DTP细胞是MRD的核心功能亚群，同时也是演化为驱动临床复发的永久耐药克隆的主要前体群体。MRD包含治疗后持续存在的所有异质性残留癌细胞，涵盖三种不同的亚群：治疗敏感的静止肿瘤细胞、遗传稳定的永久耐药克隆和短暂药物耐受的DTP细胞。DTP细胞独特地体现了MRD内可塑性的非遗传耐受部分，通过可逆的表观遗传、代谢和细胞周期适应机制在初始细胞毒性治疗中存活，并作为通向稳定获得性耐药的关键中间储库。在分子和表型水平上，DTP细胞和MRD既表现出相似性也存在差异。共同特征包括存活通路的激活、表观遗传修饰和静止状态。然而，DTP细胞的短暂性和可逆性与更广泛的MRD群体形成对比，后者可能包含携带固定突变的遗传耐药克隆。
3.4 MRD中的DTP细胞与不良临床结局相关
DTP细胞显著促进治疗失败和肿瘤复发，作为初始药物耐受与稳定性耐药发展之间的关键联系。其存活能力使其成为完全耐药细胞群体可通过遗传或表观遗传变化出现的储库。临床数据日益强调DTP相关生物标志物的预后重要性。例如，ATF3表达和部分上皮-间质转化（EMT）协同促进侵袭性DTP发展，导致高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者复发。
4 DTP细胞的形成机制及其在MRD中的关键作用
4.1 MRD中DTP细胞的生物学特征
DTP细胞表现出多种生物学特征使其能够在治疗压力下存活。一个显著特征是G0/G1期细胞周期阻滞，使其处于静止状态，对靶向增殖细胞的疗法敏感性较低。代谢重编程是另一种适应机制。在MAPK抑制剂治疗下，一部分肺腺癌细胞进入以糖酵解向线粒体呼吸转变为特征的DTP状态。这种转变通常伴随线粒体活性增加，使细胞高度依赖抗氧化通路来缓解升高的活性氧（ROS）。此外，DTP细胞通过上调MCL-1等蛋白增强抗凋亡机制。在DTP状态形成过程中，MYC下调解除对PINK1的转录抑制，导致PINK1表达增加和线粒体自噬激活，清除受损线粒体并维持线粒体稳态。
4.2 DTP在治疗阶段的动态演化
DTP细胞通过多阶段的细胞适应过程出现。在初始阶段，DTP细胞在急性药物应激下迅速产生，源于内在细胞异质性。在长期治疗期间，DTP细胞经历分子重编程，从可逆持存状态转变为潜在耐药前体。对EGFR突变肺癌细胞（PC9）和BRAF突变黑色素瘤细胞（SKMEL28）耐药演化的研究已鉴定出多种旁路通路的同步激活，包括PLC/PKC、IGF1R、STAT3和YAP，作为替代增殖信号。这些通路在耐受过程中平行运作，可能共同使细胞在TKI抑制下维持缓慢增殖。
4.3 治疗诱导的DTP细胞形成导致MRD
治疗干预通过独特的分子机制主动诱导DTP细胞形成。在EGFR突变NSCLC的靶向治疗背景下，奥希替尼等药物触发代谢重编程，DTP细胞中乙酰胆碱（ACh）高水平积累。EGFR-TKIs上调胆碱乙酰转移酶（ChAT）表达，通过M3毒蕈碱受体（M3R）激活下游WNT信号以维持DTP细胞的药物耐受状态。此外，MUC1-C已被证明在多种奥希替尼耐药细胞模型中激活EGFR/ERK/AKT信号并驱动上皮-间质转化（EMT）。抑制MUC1-C可使这些细胞对奥希替尼重新敏感。
4.4 跨癌症类型和治疗方式的背景依赖性DTP/持存者生物学
DTP/持存者生物学受癌症谱系、组织背景和治疗压力强烈塑造。在急性髓系白血病（AML）中，DTP样细胞与治疗后残留病、复发风险、静止或低增殖状态、细胞状态重编程和代谢重塑相关；线粒体适应和微环境相互作用是反复讨论的机制。在化疗后残留的AML细胞中，肾上腺髓质素-CALCRL轴已被证明调节细胞周期程序、DNA修复和线粒体氧化磷酸化。相反，实体瘤中的DTP细胞在靶向治疗模型中得到了最系统的研究，尤其是EGFR突变NSCLC。靶向治疗耐受的持存细胞常表现出慢周期或休眠特征和可逆耐受。治疗方式进一步影响定义持存状态的生物学程序。靶向治疗相关DTP细胞常以可逆表观遗传或转录适应和旁路通路激活为特征，而化疗存活的持存者可能更依赖应激耐受、线粒体适应和氧化还原缓冲机制。免疫治疗相关持存状态可能代表另一种独特的治疗诱导持久形式，PD-1阻断后的动态单细胞分析鉴定了能够抵抗CD8+T细胞杀伤的免疫治疗持存细胞，依赖Birc2和Birc3等生存因子。
4.5 肿瘤微环境在MRD中DTP细胞形成中的作用
肿瘤微环境（TME）在MRD中DTP细胞的形成中发挥关键作用。缺氧通过稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）促进DTP细胞存活，上调糖酵解酶和抗凋亡基因。癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过TGF-β和NF-κB信号的平衡调节在DTP诱导中发挥重要作用。在EGFR-TKI治疗期间，CAFs从肌成纤维细胞表型转变为以NF-κB和IL-6/JAK/STAT3信号激活为特征的新状态，进一步增强DTP细胞药物耐受。研究观察到，当肿瘤体积达到最低点并进入DTP阶段时，出现大量Ccr2+巨噬细胞浸润，与肿瘤细胞从可逆药物耐受状态向获得性耐药状态的转变同时发生。
4.6 代谢重编程在MRD中DTP细胞形成中的作用
代谢重编程是癌症细胞的标志，也是MRD中DTP细胞的关键适应策略。在BRAF(V600E)突变黑色素瘤中，DTP细胞通过代谢重编程发展出对BRAF/MEK抑制剂的耐受性，从糖酵解转向过氧化物酶体脂肪酸氧化（FAO），该过程由PPARα-ACOX1轴转录调控。研究表明DTP细胞通过ETS1-PTPN1-c-Src-CEBPβ信号轴上调Lipin1（LPIN1），促进脂滴形成以减轻脂毒性。在肥胖相关CRC中，FABP4/UCP2轴通过代谢重编程驱动西妥昔单抗耐药。
4.7 氧化还原平衡在MRD中DTP细胞形成中的作用
能量代谢向线粒体呼吸的转变使MRD中的DTP细胞高度依赖抗氧化通路来抵消升高的ROS。研究表明DTP细胞进入治疗耐受状态后依赖脂质过氧化物酶GPX4存活。在ALK阳性NSCLC中，存活于ALK-TKI治疗的DTP细胞上调GPX4以逃避ROS诱导的细胞毒性。进一步研究鉴定了多种化疗药物处理后持续存在的慢增殖细胞亚群，以H3K4去甲基化酶JARID1B高表达为特征，上调线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）相关酶以支持能量代谢。醛脱氢酶（ALDH）通过清除ROS保护耐药肿瘤细胞亚群免受氧化应激。
4.8 表观遗传重编程在MRD中DTP细胞形成中的作用
表观遗传重编程是MRD中DTP细胞的常见特征。在黑色素瘤中，缺氧或营养剥夺条件下，DTP细胞通过广泛的染色质重塑获得对BRAF抑制剂和铂类化疗的耐药性，表现为H3K9me3等表观遗传标记的丢失和获得。O-GlcNAc转移酶（OGT）上调与TET1协同，通过己糖胺生物合成途径促进CpG岛的H3K4me3沉积，驱动癌细胞从休眠DTP状态向增殖性耐药持存-增殖（DTPP）状态转变。在BRAF突变黑色素瘤中，MRD包含多种共存的DTP细胞群体，其中关键亚群表现出由核受体RXRG信号驱动的神经嵴干细胞样转录程序。此外，存活于致死药物压力的细胞增强组蛋白H3K9和H3K27甲基化，特别是在LINE-1重复元件处，形成抑制性染色质，抑制药物诱导的重复元件和干扰素刺激基因（ISGs）激活。
4.9 信号通路和转录调控在MRD中DTP细胞形成中的作用
MRD中的DTP细胞以多条信号通路和相关分子调节因子的激活为特征。在ALK阳性NSCLC中，存活于ALK-TKI治疗的DTP细胞上调GPX4并激活EGFR/HER3旁路信号。在EGFR突变肺癌中，DTP细胞通过GAS6/AXL信号轴诱导RAD18激活和低保真DNA聚合酶表达，促进易错DNA修复和高突变率，加速T790M等耐药突变的出现。在EGFR突变NSCLC靶向治疗背景下，YAP通过上调ChAT表达调节ACh代谢，ACh通过M3R激活下游WNT信号以维持DTP细胞状态。YAP、TEAD及其转录复合物有助于DTP表型的建立并影响药物敏感性。
5 靶向DTP细胞以逆转MRD的治疗策略
5.1 基于机制的治疗策略
阐明DTP细胞存活的分子机制促进了旨在根除MRD中这些耐药细胞群体的靶向策略的开发。多种对DTP表型至关重要的信号通路已成为可操作的治疗靶点。
