T细胞介导的丝裂原反应受损作为辅助临床诊断肺结核的潜在生物标志物

《Infection》：An impaired T-cell-mediated mitogen response as a potential biomarker to aid in clinical diagnosis of pulmonary tuberculosis

目的：相当比例的疑似肺结核（pTB）病例是基于临床诊断而被识别和治疗，因为通常无法确认结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染。在缺乏病原体检测的情况下，免疫学生物标志物等补充指标将有助于结核病诊断决策。 方法：这项在加纳开展的前瞻性病例对照研究中，疑似pTB患者（n?=?83）被分为三个亚组：高（pTBhigh）或低（pTBlow）Mtb痰载量的确诊病例，以及未经Mtb确认的临床诊断患者（pTBclin）。研究人员将pTB患者亚组与健康接触者（对照组；n?=?49）进行比较，评估其对Mtb抗原（即PPDMtb、ESAT6/CFP10）、丝裂原植物血凝素以及超抗原的免疫反应。 结果：约半数pTB患者为pTBclin（n?=?41；49.4%），而pTBhigh仅约占三分之一（n?=?26；31.3%），pTBlow约占五分之一（n?=?16；19.3%）。抗原特异性CD4+ T细胞反应在各pTB亚组间存在差异，仅pTBhigh组与对照组相比具有更高的IFNγ+/TNFα+ T细胞比例（PPDMtb，p?=?0.0003；ESAT6/CFP10，p?<?0.0001）。相反，植物血凝素在所有结核病亚组中诱导的CD4+ T细胞比例显著降低（pTBhigh，p?<?0.0001；pTBlow，p?=?0.0039；pTBclin，p?=?0.0012，针对IFNγ+/TNFα+），且该测量能有效区分患者亚组与对照组（pTBhigh，p?<?0.0001；pTBlow，p?=?0.0132；pTBclin，p?=?0.0006，针对TNFα+/CD40L+）。最后，植物血凝素诱导的TNFα+/CD40L+ T细胞反应在区分伴有严重肺部表现的pTBclin与对照组方面效率最高（AUC?=?0.9；p?<?0.0001；95%CI：0.82–0.98）。 结论：本研究强调了临床pTB诊断的重要性，并确定了对植物血凝素反应减弱的T细胞细胞因子反应可作为潜在生物标志物。

论文解读

一、研究背景与问题

肺结核（pTB）作为成人中最常见的结核病形式，其诊断金标准是在痰液中检测结核分枝杆菌复合群病原体。然而，直接检测方法（如痰涂片显微镜检查、GeneXpert）并非对所有疑似pTB患者都能成功，而病原体培养过程漫长且易出错。因此，在部分疑似pTB患者中，抗分枝杆菌治疗是在未确认Mtb感染的情况下启动的。这类诊断依赖临床症状（包括长期咳嗽、发热、盗汗、胸痛、体重减轻和血痰）、肺部结构改变（如通过胸部X光）以及与pTB患者的接触史，被称为“临床诊断”。根据2025年世界卫生组织（WHO）结核病报告，全球临床诊断结核病病例占报告病例的36%至38%，且地区差异显著。在加纳等低收入、高结核病负担国家，临床诊断pTB的比例尤其高，但可靠数据稀缺。

由于pTB症状的非特异性，临床误诊可能性很大，尤其是在大多数pTB病例未经细菌学确认的中低收入国家。为降低误诊可能性，能够可靠指示pTB疾病的免疫反应生物标志物将大有帮助。识别此类免疫生物标志物必须考虑受影响人群中Mtb感染的高流行率，因为大部分Mtb感染者（成人中约90%）不出现临床症状（即潜伏性Mtb感染），需与需要治疗的pTB患者区分。既往研究已发现pTB患者免疫反应的变化，包括抗原特异性T细胞上的标志物以及其他免疫病理效应。一个充分记录的pTB特征是机体对某些丝裂原（如植物血凝素，PHA）的免疫反应降低。研究人员近期研究还表明，pTB患者中PHA诱导的T细胞反应降低与单核细胞介导的T细胞支持功能受病理抑制有关。

识别临床诊断患者新型生物标志物的一个显著挑战在于，迄今为止大多数研究都排除了未检测到病原体的患者。这在排除误诊患者方面可以理解，但同时也意味着目前关于支持pTB临床诊断的潜在生物标志物数据不足。为此，研究人员开展这项前瞻性病例对照研究，招募疑似pTB患者，并基于全面的分枝杆菌诊断，区分出确诊Mtb感染（pTB_high和pTB_low）与未确认感染（pTB_clin）的患者，将其与健康家庭接触者（对照组）在Mtb抗原、超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）和丝裂原PHA诱导的T细胞反应方面进行比较，以期发现能区分不同研究组的免疫学特征。

二、研究设计与关键方法

本研究于2025年3月至8月期间，从加纳库马西及周边阿散蒂地区的五家医院（库马西南部政府医院、夸梅·恩克鲁玛科技大学医院、阿特布布-阿曼廷市医院、塞内西区医院、阿戈戈长老会医院）招募了83名疑似pTB患者和49名健康家庭接触者作为对照组。pTB诊断由经验丰富的肺科医生根据症状、病史和胸部X光片作出。纳入标准为具有提示pTB的症状，排除标准为已知HIV感染及其他可能引起症状的肺部疾病。所有pTB患者在开始抗分枝杆菌治疗前入组。对照组为与活动性pTB指示患者在同一家庭居住至少两周的密切接触者。研究经库马西KNUST伦理委员会和杜塞尔多夫海因里希·海涅大学医学院伦理委员会审查批准。

主要技术方法包括：痰液样本经NALC-NaOH去污染处理后，采用Ziehl-Neelsen染色进行痰涂片镜检抗酸杆菌（AFB）；所有样本按制造商说明进行GeneXpert MTB/RIF Ultra检测；GeneXpert阴性样本使用BACTEC MGIT 960系统进行MGIT培养，并用TBcID试剂盒确认Mtb复合群。根据检测结果将患者分为pTB_high（GeneXpert阳性且痰涂片阳性）、pTB_low（GeneXpert阳性但痰涂片阴性，或MGIT培养/TBcID阳性）和pTB_clin（所有检测均阴性）。对部分pTB_clin患者的胸部X光片由独立专家肺科医生评估肺部改变的严重程度。

免疫学检测采用全血过夜体外刺激进行细胞内细胞因子分析：稀释全血（1:1于RPMI）分别用ESAT6/CFP10（2 μg/ml）、PPD_Mtb（10 μg/ml）、PHA（10 μg/ml）或SEB（2 μg/ml）刺激，在Brefeldin A存在下过夜培养后，用流式细胞术检测CD4⁺ T细胞中IFNγ、TNFα、CD40L等细胞因子的表达。统计分析采用非参数检验（Mann-Whitney U检验）、受试者工作特征（ROC）曲线分析以及多变量线性回归模型，并对主要检验进行Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正。

三、研究结果

pTB患者中PPD_Mtb特异性CD4⁺ T细胞反应升高而PHA反应降低

研究人员首先比较了全部pTB患者与健康家庭接触者的免疫反应。结果显示，抗原特异性差异总体温和，仅在PPD_Mtb刺激后pTB患者的TNFα⁺和CD40L⁺ T细胞比例较高；ESAT6/CFP10仅在CD40L方面诱导pTB患者CD4⁺ T细胞比例增加；抗原特异性激活后两组间IFNγ表达无差异。值得注意的是，pTB患者对丝裂原PHA的反应显著降低，表现为CD40L、TNFα和IFNγ阳性T细胞比例均较低。相比之下，SEB诱导的T细胞反应在两组间相当。细胞因子谱分析显示，PHA诱导的pTB患者反应降低影响了所有细胞因子表达T细胞亚型，而PPD_Mtb刺激后pTB患者中主要是TNFα阳性CD4⁺ T细胞亚型（如TNFα/IFNγ、TNFα/CD40L、TNFα/IFNγ/CD40L阳性亚群）水平升高。

临床诊断pTB患者占所有入组患者的一半

所有疑似pTB患者根据痰中病原体可检测性和病原体载量进行分类。研究发现约50%的入组患者是基于临床诊断（pTB_clin）被识别和治疗，pTB_high约占三分之一（31.3%），pTB_low约占五分之一（19.3%）。基于临床症状的亚组比较显示差异温和，仅细菌学确诊pTB患者的发热比例显著高于临床诊断pTB患者。

高病原体载量pTB患者中PPD_Mtb特异性TNFα表达T细胞比例升高

pTB患者亚组与对照组的T细胞反应比较显示，抗原特异性T细胞反应的差异主要出现在细菌学确诊的pTB患者中。PPD_Mtb和ESAT6/CFP10均主要在pTB_high和pTB_low患者中诱导显著更高的TNFα/CD40L阳性T细胞比例。就TNFα/IFNγ阳性T细胞而言，仅pTB_high患者相比其他患者和对照组具有更高的PPD_Mtb和ESAT6/CFP10特异性T细胞比例。pTB_clin仅表现出中度的抗原特异性T细胞反应。对细胞因子阳性T细胞上HLA-DR表达的分析显示与单独细胞因子表达T细胞相似的差异，但组内HLA-DR表达变异较大，质疑其作为生物标志物的适用性。

PHA诱导的T细胞反应受损可区分pTB患者亚组与对照组

与抗原特异性细胞因子表达相反，丝裂原PHA在所有pTB患者亚组中诱导了显著差异。pTB_high、pTB_low和pTB_clin患者的TNFα/IFNγ和TNFα/CD40L阳性T细胞比例均显著低于对照组，而pTB患者亚组间无显著差异。多变量分析显示，年龄与两种细胞因子谱呈适度但显著的负相关，性别无显著影响；即使在调整年龄和性别后，研究组因素仍与两种细胞因子谱强相关，pTB患者的反应显著更低。ROC分析显示，所有患者亚组与对照组的区分均显著，其中TNFα/CD40L阳性T细胞比例的区分效果略优于TNFα/IFNγ。pTB_clin患者的分类准确率虽略低于pTB_high患者，但仍显著区别于对照组。两种主要PHA诱导细胞因子谱的pTB对对照组效应在FDR校正后仍保持统计显著。

伴有严重肺部表现的pTB_clin患者PHA反应特别低

胸部X光检查是pTB诊断的重要组成部分。研究人员让独立专家肺科医生评估了大多数pTB_clin患者（n?=?32，78%）的胸部X光片，将其分为严重肺部结构改变（n?=?19）和轻度改变（n?=?13）。有趣的是，伴有严重肺部改变的pTB_clin患者表现出均一的低PHA反应，其TNFα/CD40L阳性T细胞比例显著低于中度改变患者。ROC分析显示，基于降低的PHA反应，伴有严重肺部改变的pTB_clin患者能有效与对照组区分（AUC：0.9，p?<?0.0001）。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，临床诊断pTB是治疗疑似病例的重要基础，尤其在加纳等高pTB患病率国家。然而，缺乏病原体检测始终存在误诊风险。本研究中pTB患者的平均Mtb抗原特异性T细胞反应较高，但各亚组间差异及pTB_low和pTB_clin相比对照组的仅适度升高，使抗原特异性T细胞反应不适合作为分类指标。即使纳入近期激活标志物HLA-DR也未显著改变这一情况。研究人员认为，与既往研究的差异可能在于本研究队列纳入了低痰载量或无Mtb痰载量的患者，而既往研究多聚焦于高痰载量pTB患者；此外，本研究对照组为与pTB患者有确认接触的个体，而非既往研究常用的IGRA阳性对照，这可能影响激活标志物在对照组CD4⁺ T细胞上的表达。

所有pTB患者亚组对PHA的免疫反应均显著低于健康家庭接触者。尽管个体T细胞对PHA刺激的反应存在变异性，但降低的平均反应在各pTB亚组间相当。ROC分析显示，所有pTB患者亚组与对照组的分类能力均高度显著，且伴有严重肺部表现的pTB_clin在分类分析中表现非常好，甚至优于pTB_high和pTB_low。这些结果表明，PHA诱导的T细胞反应受损可能作为pTB的辅助指标具有价值。既往研究已证明pTB与PHA反应降低之间的联系，这种降低发生在大多数pTB患者的急性期，并在治疗最初几周内恢复正常。PHA反应降低也与白细胞介素-6等炎症细胞因子相关。但需注意，PHA反应降低也见于脓毒症、COVID-19和慢性炎症性疾病等其他病理状况，因此用作pTB_clin生物标志物时应排除其他可能触发疾病。

关于检测灵敏度，并非所有pTB患者都表现出明显降低的PHA反应，自然变异进一步使阈值确定复杂化。在此背景下，急性期使用个体值作为生物标志物可能效果有限。由于既往研究显示PHA反应在治疗最初几周内恢复正常，该生物标志物可考虑作为治疗成功的指标，这也可能随着疾病进展确认最初的临床诊断。一般而言，免疫生物标志物在临床实践中的实施受限于需要复杂的实验室检测，特别是流式细胞术分析在撒哈拉以南非洲等高pTB患病率地区目前尚不可行。需要强调的是，PHA反应降低是有前景的生物标志物，可补充但不能替代微生物学诊断。

研究人员指出，据其所知，这是少数评估免疫生物标志物以表征大量未经细菌学确认的pTB病例的研究之一，为未来在临床诊断pTB病例中识别生物标志物奠定了重要基础。然而，该病例对照研究在将PHA反应降低用作生物标志物方面的意义受限于队列规模、单一国家研究设计以及缺乏对临床诊断pTB患者的随访。此外，需要适当研究设计的外部验证研究来评估PHA反应降低作为pTB辅助生物标志物或作为pTB_clin患者抗分枝杆菌治疗补充指标的价值，同时排除可能产生类似结果的其他病理状况。

研究结论：本研究强调了临床pTB诊断的重要性，并确定了对植物血凝素反应减弱的T细胞细胞因子反应可作为潜在生物标志物。