巨噬细胞干扰素调节因子7通过放大肝脏炎症加速代谢功能障碍相关脂肪性肝炎进展

《Molecular Biomedicine》：Macrophage interferon regulatory factor 7 aggravates the progression of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是一种日益增长的临床负担，其患病率不断上升，且缺乏已获批的药物治疗方案。干扰素调节因子7（IRF7）是I型干扰素依赖性免疫应答的核心介质，然而巨噬细胞表达的IRF7在MASH发病过程中塑造炎症和代谢事件的具体机制尚未完全阐明。本研究旨在剖析IRF7在MASH发展中的功能作用。研究人员评估了人类和小鼠肝脏标本中IRF7的表达，并利用髓系特异性Irf7缺陷小鼠饲喂高脂高胆固醇饮食（HFHCD）或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）以重现MASH病理。IRF7在受MASH影响的肝脏中显著升高，髓系特异性Irf7缺失显著缓解了MASH进展。机制上，IRF7缺失削弱了IFN-α和IFN-β的产生，抑制了巨噬细胞来源的I型干扰素依赖性免疫级联反应。IRF7直接结合促炎性Tnfa和Il1b的启动子以增强其转录，并与SMAD3相互作用以激活Tgfb1转录。E3泛素连接酶HUWE1介导IRF7的单泛素化以增强其核转位，驱动促炎和促纤维化基因的转录。这一分子级联加剧了肝脏脂肪变性并触发肝星状细胞（HSC）活化，加速了MASH恶化。药理学IRF7抑制有效对抗了这些病理改变。总之，髓系IRF7通过放大巨噬细胞介导的肝脏炎症推动MASH进展，提示IRF7是MASH一个有前景的治疗靶点。

一、研究背景与科学问题

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）已成为全球最常见的慢性肝病。代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）以肝脏脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变为特征，可伴或不伴窦周纤维化，与进行性肝损伤相关，可导致肝硬化和肝细胞癌。多数MASLD病例无症状、异质性高且难以诊断，现有策略如长期减重和体育锻炼难以坚持，获批药物有限，因此阐明驱动MASH进展的分子机制对于开发有效治疗方案至关重要。

巨噬细胞通过产生TNF-α和IL-6等促炎细胞因子在MASLD进展中发挥关键作用。MASH期间，炎症信号招募循环单核细胞进入肝脏，分化为单核细胞来源的巨噬细胞，导致肝脏巨噬细胞群显著扩张。既往研究已揭示巨噬细胞中I型干扰素（IFN）信号在MASH进展中发挥关键调控作用。干扰素调节因子（IRFs）是IFN信号和巨噬细胞介导的固有及适应性免疫应答的关键转录调控因子。其中IRF7是I型IFN信号的关键调控因子，磷酸化后转位入核并结合靶基因中的干扰素刺激反应元件（ISRE），促进IFN-α、IL-6和TNF-α等细胞因子产生。已有研究报道IRF7在心脏纤维化中发挥重要作用，IRF7可与TGF-β信号核心介质SMAD3相互作用，且IRF7缺陷可预防饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。然而，巨噬细胞中IRF7调控MASH进展的作用和具体机制尚不清楚。该研究旨在利用两种小鼠MASH模型，系统阐明巨噬细胞IRF7在MASH发病中的功能角色和分子机制。论文发表在《Molecular Biomedicine》。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员利用40例MASH患者和40例正常对照的肝脏样本进行基因表达分析和病理评估；采用髓系特异性Irf7敲除小鼠（Irf7^ΔM?），通过高脂高胆固醇饮食（HFHCD）或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）诱导MASH模型；运用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析（GSE129516数据库）；对脂多糖（LPS）预刺激并经棕榈酸/油酸（PAOA）处理的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）进行转录组RNA测序（RNA-seq）；采用染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因实验验证转录调控机制；通过免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（MS）鉴定相互作用蛋白；利用甘露糖偶联聚合物递送Irf7 siRNA实现巨噬细胞特异性体内敲低；并采用GLP-1受体激动剂利拉鲁肽进行药理学干预验证。

三、主要研究结果

IRF7在MASH患者和小鼠肝脏中表达上调并被激活。 在40例MASH患者肝脏组织中检测到巨噬细胞数量增加和IRF7基因表达升高，肝内IRF7表达与血清转氨酶（ALT、AST）水平及炎症标志物（Tnfa、Il6）呈正相关。双免疫荧光染色显示活化IRF7（p-IRF7）与巨噬细胞标志物CD68显著共定位，主要定位于细胞核，而与其他细胞类型标志物无明显重叠。小鼠实验中，HFHCD或MCD喂养的MASH模型小鼠肝脏巨噬细胞中Irf7表达增加。临床相关性分析显示，IRF7低表达组患者肝脂肪变性和纤维化程度显著低于高表达组，NAFLD活动度评分和纤维化评分与IRF7 mRNA水平正相关。

巨噬细胞特异性Irf7缺陷减轻小鼠MASH。 通过分析GSE129516 scRNA-seq数据，鉴定出13种主要肝脏细胞类型，发现MASH组织中浸润巨噬细胞比例显著增加，Irf7在浸润巨噬细胞和Kupffer细胞中表达显著升高且高于其他细胞类型。研究人员构建了Lyz2-Cre介导的巨噬细胞特异性Irf7敲除小鼠，结果显示Irf7^ΔM?小鼠在HFHCD和MCD饮食下均显著免受MASH损伤，表现为肝组织学改善、油红O和α-SMA染色减少、F4/80炎症细胞浸润降低、NAFLD活动度评分（NAS）、肝甘油三酯（TG）、血清ALT、血糖及TNF-α水平显著降低。

IRF7调控巨噬细胞I型干扰素信号环路。 RNA-seq和GO分析显示Irf7敲除后差异基因主要富集于干扰素介导的免疫应答。活化的Irf7^ΔM? BMDMs中Ifna1和Ifnb1表达及IFN-α、IFN-β分泌水平显著降低。外源性IFN-α或IFN-β通过激活JAK/STAT信号促进STAT1/STAT2与IRF9结合，进而诱导Irf7表达，JAK1抑制剂itacitinib可阻断该过程，形成IRF7调控的I型干扰素正反馈环路。

巨噬细胞IRF7通过调控炎症反应促进肝细胞脂质蓄积和促炎细胞因子表达。 KEGG分析显示Irf7敲除后TNF信号通路显著受抑。生物信息学预测并在Tnfa启动子（?1862/?1849）和Il6启动子（?897/?884）验证了IRF7结合位点，ChIP和荧光素酶实验证实IRF7直接结合并浓度依赖性激活Tnfa和Il6转录。巨噬细胞与肝细胞共培养实验表明，Irf7敲除显著减少肝细胞脂质沉积和炎症反应。

巨噬细胞IRF7通过与SMAD3相互作用调控Tgfb1转录促进肝星状细胞活化。 双免疫荧光和Co-IP实验证实活化IRF7与SMAD3在活化巨噬细胞中结合并共定位于细胞核，SMAD3的251–425氨基酸区域介导与p-IRF7的相互作用。SMAD3过表达可恢复Irf7^ΔM?巨噬细胞中Tgfb1表达，Smad3敲低则抑制Tgfb1表达。ChIP验证了Tgfb1启动子（?163/?154）的SMAD3结合位点，荧光素酶实验证实SMAD3浓度依赖性激活Tgfb1转录。巨噬细胞条件培养基处理原代肝星状细胞（HSC）的实验表明，Irf7敲除显著抑制HSC活化标志物Acta2、Col1a1和Timp1表达。

IRF7受HUWE1调控以调节巨噬细胞炎症反应。 通过IP结合质谱筛选鉴定出E3泛素连接酶HUWE1与IRF7相互作用。Co-IP证实IRF7（而非p-IRF7）与HUWE1结合，二者主要共定位于细胞质。泛素化分析显示HUWE1介导IRF7的单泛素化，Huwe1敲低显著降低IRF7单泛素化水平（IRF7-Ub1）、p-IRF7蛋白水平及ISRE转录活性，表明HUWE1通过单泛素化促进IRF7核转位和下游转录活性。

巨噬细胞特异性Irf7敲低和药理学干预减轻MASH进展。 采用甘露糖偶联聚合物递送Irf7 siRNA可显著且特异性地降低肝脏巨噬细胞中Irf7表达，Irf7 siRNA处理减轻了HFHCD和MCD诱导的MASH进展，表现为油红O和α-SMA染色减少、NAS评分、血清ALT和肝TG降低，纤维化标志物Acta2、Col1a1和Timp1表达下调。利拉鲁肽给药同样减轻MASH进展并显著抑制Irf7表达。

四、讨论与结论

讨论部分指出，肝脏巨噬细胞主要分为定居Kupffer细胞（KC）和浸润性骨髓来源巨噬细胞（BMDM），在MASH进展中BMDM逐渐取代KC成为主要巨噬细胞群体。巨噬细胞IRF7通过靶向促炎基因（Tnfa、Il1b）和促纤维化基因（Tgfb1）启动子，抑制I型IFN依赖性免疫应答，减少促炎和促纤维化细胞因子分泌，从而减轻肝脂肪变性和HSC活化。IRF7作为I型IFN应答的核心调控因子，其缺陷可预防饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。HUWE1介导的IRF7非降解性单泛素化促进其核转位和转录活性，是IRF7功能的重要翻译后修饰调控机制。研究局限性包括：功能证据主要来自小鼠遗传模型，人类MASH中巨噬细胞IRF7的因果作用尚需正式验证；研究聚焦于巨噬细胞内在IRF7功能，不能完全排除其他肝细胞类型中IRF7的潜在贡献；未完全解析其他E3连接酶或去泛素化酶是否也调节IRF7活性；IRF7抑制的治疗推断基于遗传敲除证据，药理学靶向IRF7仍需进一步的临床前测试以评估药物递送、疗效和安全性。

研究结论：巨噬细胞中Irf7缺陷通过抑制巨噬细胞I型IFN依赖性免疫应答减轻MASH。IRF7靶向促炎基因（Tnfa和Il1b）启动子促进促炎基因转录，并与SMAD3结合靶向Tgfb1启动子促进其转录。IRF7促进炎症和纤维化细胞因子的产生，导致肝脂肪变性和HSC活化。E3泛素连接酶HUWE1与IRF7结合，增加IRF7单泛素化并促进其入核以驱动下游转录。IRF7抑制可阻断MASH进展，提示抑制IRF7表达可能是MASH管理的有效治疗策略。